[发明专利]用于制备L－抗坏血酸和D－异抗坏血酸的微生物方法

说明书

本发明涉及用以制备L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸及它们的盐的一种新的微生物方法。更具体地说，本发明涉及采用嗜酸性耐热微生物，分别从2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸制备L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸，或从这些起始物的适合盐制备相应的盐的一种新方法。L-抗坏血酸(维生素C)不仅广泛用于医疗保健也广泛用于食品、动物饲料如鱼料、和化妆品。D-异抗坏血酸主要作为抗氧化剂用于食品添加剂。

通过熟知的Reichstein方法(Helv.Chim.Acta 17，311-328，1934)已从D-葡萄糖生产L-抗坏血酸。在这一多步骤方法中，通过化学方法从中间物2-酮-L-古洛糖酸得到L-抗坏血酸。这一方法用于商业用途已有60余年，期间有许多化学和技术上的改进以提高达到中间物D-山梨糖醇、L-山梨糖、二丙酮基-L-山梨糖、二丙酮基-2-酮-L-古洛糖酸、2-酮-L-古洛糖酸和2-酮-L-古洛糖酸甲酯，和终产物L-抗坏血酸的每一个步骤的效率。D-山梨糖醇转化成L-山梨糖是唯一的微生物步骤，其余都是化学步骤。将二丙酮基-2-酮-L-古洛糖酸转化成L-抗坏血酸有两种不同的方法：1)去保护以得到2-酮-L-古洛糖酸，随后用甲醇酯化及碱催化环化；和2)直接从受保护的或去保护的2-酮-L-古洛糖酸用酸催化环化为L-抗坏血酸。这些转化过程必须在非水性或少水的反应介质里进行。无论从环保还是经济的角度出发，优选用无有机溶剂的反应。

而D-异抗坏血酸从D-葡萄糖经2-酮-D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸甲酯制备，2-酮-D-葡糖酸本身能从属于假单胞菌属的菌株通过发酵产生。

人们投入许多时间和精力来寻找用微生物生产L-抗坏血酸的其它方法。关于用微生物生产L-抗坏血酸的研究大多数集中在中间物2-酮-L-古洛糖酸的生产上，特别是从L-山梨糖(G.Z.Yin等，Sheng Wu HsuehPao.20，246-251，1980；A，Fujiwara等，EP 213 591；T.Hoshino等，US专利4960695；和I.Nogami等，EP 221707)，D-山梨糖醇(A.Fujiwara等，EP213591；T.Hoshino等，US专利5,312,741；M.Niwa等，WO95/23220；和S.F.Stoddard等，WO98/17819)或从D-葡萄糖经2，5-二酮-葡糖酸用单一或混合或重组培养物(T.Sonoyama等，Appl.Environ.Micvobiol.43，1064-1069，1982；和S.Anderson等，科学(Science)230，144-149，1985)生产。然后2-酮-L-古洛糖酸能用上述化学方法转化为L-抗坏血酸。

最近在美国专利6,022,719(J.C.Hubbs)里报道过将2-酮-L-古洛糖酸酯转化成L-抗坏血酸的生物学方法。这份专利里描述了一种通过2-酮-L-古洛糖酸或其酯与选自蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶的水解酶催化剂接触来生产L-抗坏血酸的方法。该专利举例说明了从2-酮-L-古洛糖酸的酯如2-酮-L-古洛糖酸丁酯形成L-抗坏血酸，而不是从2-酮-L-古洛糖酸自身来形成L-抗坏血酸。例如，该专利公开了，Candida antarticaB脂肪酶在8.6％甲醇中、pH3.1-3.2、38℃时催化从1％(w/v)2-酮-L-古洛糖酸形成413-530毫克/升2-酮-L-古洛糖酸甲酯而不是L-抗坏血酸的反应。Candida antartica B脂肪酶在酸性pH下对2-酮-L-古洛糖酸，一种α-酮-羧酸，有明显的酯合成活性，但这种脂肪酶的分子内酯形成可以忽略不计。

除了水解酶反应，酯键合成例如蛋白质(氨基酯)，脂肪酸酯(羧基酯)，和核苷酸链(磷脂)的酯键合成在细胞中的功能活性也是很强的。与水解酶的逆向反应相比，甚至在水相中，该反应仍单方向进行并很少被产物所抑制。这类反应系统需要活化酯如活化的转移核糖核酸(tRNA)，腺苷三磷酸(ATP)和乙酰辅酶A(acyl-CoA)等的供应，它们在细胞能量转换代谢中产生。该反应的“体外”重建需要能量供体如ATP的化学计量供应或再生系统，这些能量供体对于商业化生产维生素和精细化学产品如L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸是昂贵的。商业上，利用完整细胞是优选方法之一。