[发明专利]抗鸡传染性法氏囊病毒单克隆抗体的生产工艺

说明书

技术领域：本发明涉及的是一种单克隆抗体的生产工艺，特别是一种抗鸡传染性法氏囊病毒单克隆抗体的生产工艺，属于农业生物技术领域。

背景技术：鸡传染性法氏囊病(IBD)是一种呈现世界性流行的烈性传染病，其病毒(IBDV)主要侵害鸡体的免疫器官，造成免疫抑制，已成为危害养鸡业的三大主要疫病之一。90年代初，由于该病大流行，死亡率从原来15％左右突然上升到30-50％，导致大批鸡场关闭，损失严重。国内外对IBD的诊断、免疫预防进行了一定的研究，但由于多方面的原因，在推广应用上均具有一定的难度。而近年来，由于超强毒株或变异株的出现，又使本病的发生和流行出现了新的特点，传统的疫苗不能提供足够的保护，加重了对养鸡业的危害，给诊断、预防和治疗带来了新的困难。经对背景技术的文献检索，发现杨艳艳等发表了“高亲和力抗IBDV单克隆抗体的产生与免疫学鉴定”一文，中国免疫学杂志，2000，16(7)：384-386。其单克隆抗体的制作方法仍沿用经典的长程免疫方法，没作改进，即应用IBDV抗原免疫8周龄Balb/c小鼠，经多次加强免疫，约90天后将免疫脾细胞与NSO瘤细胞融合，通过对杂交瘤细胞培养上清进行ELISA检测和鉴定，筛选出分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果获得分泌单克隆抗体的杂交瘤21株，其中4株YNZ-1、YNZ-12、YNZ-8和YNZ-26亲和力高。其单抗的生产，也应用传统的小鼠腹水生产法，关键生产技术尚未从体内转到体外。进一步文献检索中均未见有应用细胞反应器规模生产抗IBDV单克隆抗体的报道。

发明内容：本发明首先确立以分离纯化的超强毒，应用短程免疫及细胞融合技术构建分泌抗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并建立以Fibra-Cel为载体，进一步应用细胞反应器规模培养杂交瘤细胞、高效表达单抗的基础培养条件、系统参数及灌注培养模式，最后确定单克隆抗体规模纯化的具体参数。本发明中所涉及工艺的具体方法进一步描述如下：

1、纯化病毒，收集含病毒的相应条带，用0.01M的TNE(pH7.2)透析，用福林-酚法测定病毒含量，用电镜观察病毒形态。将从上海地区发病鸡场分离、鉴定的一株鸡传染性法氏囊病病毒超强毒，测定其半数鸡胚感染量(EID₅₀)，然后采用10⁵EID₅₀的病毒经口服和滴鼻感染4周龄的SPF鸡，攻击后3天，扑杀鸡群，无菌采取鸡法氏囊，冻于-70℃，取法氏囊，称重，按1/5(W/V)加入0.01M的TNE(pH7.2)，匀浆。冻融三次，12000RPM，4℃离心30分钟，取上清，将上清以35000RPM，4℃离心3小时，将沉淀用0.01M的TNE(pH7.2)悬浮后，进行蔗糖密度梯度离心，45000RPM，4℃离心3小时。

2、构建杂交瘤细胞，将纯化的病毒采用脾脏直接免疫法免疫10周龄Balb/c小鼠，首先将小鼠采用乙醚麻醉，用碘酊等消毒创口，手术后牵引出脾脏，纵向注入IBDV约20μg，将脾脏复位，缝合伤口，一周后，取出脾脏，制备脾脏细胞，取脾脏细胞与SP2-0骨髓瘤细胞进行融合，用HAT、HT及ELISA进行阳性克隆的筛选与鉴定，并采用有限稀释法进行亚克隆。获得数株高表达单克隆抗体的杂交瘤细胞，进一步进行染色体鉴定、抗体亚型测定、抗体的特异性测定、抗体的亲和力测定以及中和抗体的鉴定与中和指数测定等，经传30代稳定后，作为细胞株保存。

3、单克隆抗体的生产方法，首先应用细胞瓶进行杂交瘤细胞体外的小量培养，制备种子细胞，所用培养基为含8％小牛血清的1640。然后转入1.5升的动物细胞反应器进一步增殖种子细胞，待其生长到一定的密度，再转入5升的动物细胞反应器进行规模培养，细胞反应器经过改良，应用Fibra-cel载体进行杂交瘤细胞的培养，该载体为细胞定居和生长提供了很大的空间。动物细胞反应器规模培养杂交瘤细胞的基础培养条件和系统参数为：接种浓度为3.0×10⁸个/升、pH7.0、溶氧55、转速50RPM、温度37℃、葡萄糖浓度为4.5克/升，当糖含量下降到2克/升浓度，进行灌注生产，灌注速度通过测定罐中的葡萄糖的消耗水平进行调节，即可获得较高滴度的单克隆抗体的粗制品。