[发明专利]蚯蚓纤溶酶的提取方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其是蚯蚓纤溶酶的提取。

蚯蚓纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶，属胰蛋白酶，类似于血纤维蛋白溶酶，它能水解蛋白质底物(如酪蛋白)、碱性氨基酸的酯(BAEE)及酰胺，并具有强烈的溶解血纤蛋白的作用。其主要应用是作为治疗血栓类疾病的药原。

目前，血栓病、心血管疾病是一种严重危害人类健康的多发性疾病。理想的溶栓药物要求可迅速溶解血栓、无毒、无出血等副作用，给药方便，价格便宜。寻找有效的治疗药物是国内外医学界重点攻关的热点之一。鉴于蚯蚓纤溶酶能溶解血栓，无毒副作用，可口服给药，生产成本低廉，人们期望能将蚯蚓纤溶酶开发成一种新型的溶栓药剂。当前，市售溶栓胶囊、地龙胶囊、“9.12”胶囊等只是蚯蚓冻干粉，酶的纯度和比活较低，且为口服，易被分解见效慢，临床应用效果较差。分离纯化出纯度高，比活力高的蚯蚓纤溶酶便成为重中之重。

本发明的目的在于提供一种蚯蚓纤溶酶的提取方法，制备出纯度高，酶比活力高的蚯蚓纤溶酶，为该酶的更好实际应用打下基础。

本发明是这样实现的：

(1)以环毛蚓为原料，用水将冲洗干净：

(2)原料匀浆：按1∶2(W/V)的比例加入0.1mol/L，pH7.5的磷酸缓冲液，匀浆；

(3)抽提：将匀浆置于4℃下，将环毛蚓中的纤溶酶抽提完全，4℃下10000r/min离心，弃沉淀，取上清；

(4)热变性：将上清液于55℃水浴保温30min，流水冷却，在4℃下10000r/min离心，取上清；

(5)分部盐析：在热变性的上清液中加(NH₄)₂SO₄达30％饱和度，在4℃下10000r/min离心，收集上清液；再加入(NH₄)₂SO₄达70％饱和度，在4℃下10000r/min离心，收集沉淀；

(6)将沉淀溶于pH7.8，0.02mol/L的磷酸缓冲液中，透析时间为8～12小时以除去酶液中的(NH₄)₂SO₄，在4℃下10000r/min离心，取上清液即为粗酶溶液；

(7)Sephadex G-75洗脱；将粗酶溶液上Sephadex G-75柱层析，柱的规格为2.0cm×60.0cm，以pH7.8，0.02mol/L的磷酸缓冲液1ml/min的速度洗脱，收集活性峰酶液，每管4ml；

(8)DEAE-Cellulose离子交换柱层析。将过Sephadex G-75的活性峰洗脱液上DEAE-Cellulose柱，柱的规格为3.0cm×30.0cm，以含0.1-0.6mol/LNaCl的pH7.8，0.02mol/L的磷酸缓冲液梯度洗脱，洗脱速度为0.4ml/min，收集活性峰洗脱液，每管4ml，透析时间为8～12小时以除去酶液中的NaCl，在4℃下10000r/min离心。收集上清液即为纯化酶溶液。

蚯蚓纤溶酶的特征：

酶的相对分子量为2.3-3.3Kd。

酶蛋白等电点为pH3-4。

酶的酸碱稳定性和作用最适pH分别为pH5.8-10.0和pH7.8。

酶的热稳定性和最适作用温度分别为20-55℃和55℃。

贮藏稳定性：溶液酶在室温下放置5个月活力基本没变。

K_m(BAEE)：1.24×10^-3mol/L。

酶活性抑制剂：PMSF(苯甲磺酰氟)、Hg²⁺

酶活力：(底物为酪蛋白)2080U/mg蛋白质

酶活力的测定方法：

(1)酪蛋白为底物

称取lg酪蛋白，加入100ml，0.05mol/L，pH7.8 Tris-HCl缓冲液，60℃水浴溶解，并定容至100ml，酪蛋白溶液浓度为1％。吸取0.5ml酶液于水溶上保温10min，然后加入2ml在37℃预保温的底物溶液，摇匀后保温15min，立即加入2ml10％三氯乙酸溶液终止反应。室温静置30min后过滤。测定滤液在280nm波长下的光密度值。在上述条件下以280nm波长下光密度值变化0.001个单位的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

(2)以BAEE为底物