[发明专利]肝靶向重组PEGFP－ATK质粒纳米粒制剂

说明书

技术领域

本发明与基因药物有关，尤其与治疗肝癌的基因药物纳米粒制剂有关。

技术背景

恶性肿瘤是当今世界威胁人类生命健康的主要杀手。传统的放疗化疗及手术治疗等方法存在着毒副作用大，对中晚期癌症患者疗效差等缺陷，九十年代以来肿瘤基因治疗作为一种全新的生物疗法已蓬勃兴起，它是一种具有巨大潜力和生命力的方法。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)是一种药物敏感基因，又称自杀基因，该基因与某些核苷酸类似物如GCV作用时，HSV-TK能够催化其磷酸化，从而抑制细胞DNA聚合的活性或作为底物掺入新合成的DNA中，导致DNA合成中止，细胞死亡，因此把HSV-TK导入肿瘤细胞，利用GCV诱导细胞死亡已成为肿瘤基因治疗的重要方法之一。

但普通的基因药物不具有特异的组织器官靶向性，对正常细胞组织也会造成损害，此外普通的基因药物不含报告基因，不便于在治疗过程中的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有肝脏靶向性，具有缓释性，对肝癌治疗效果良好，便于检测的肝靶向重组p^EGFP-ATK质粒纳米粒制剂。本发明是这样实现的：

一种肝靶向重组p^EGFP-ATK质粒纳米粒制剂，以质粒p^UC-AFPlb，p^EGFP和p^NGVL-TK为原料，先用常规法大抽三种质粒，然后分别用限制性内切酶HindIII和EcoRI消化p^UC-AFPlb分离纯化得800bp的AFP-Alb增强子-启动子片段，用限制性内切酶HindIII-SmaI消化p^NGVL-TK，分离纯化得1125bp的TK片段，用限制性内切酶HindIII-SmaI消化真核表达载体p^EGFP，分离纯化得线性化载体片段，然后将该消化载体片段与AFP-Alb启动子片段进行5′端定向连接，酚抽提，乙醇沉淀后再用此连接产物与HindIII-SmaI消化TK片段进行3′端定向连接，再次，酚抽提，纯化，然后用绿豆芽核酸酶MB处理5′突出端后，再进行平端连接，得重组质粒，将聚酯载体，吐温80用有机溶剂溶解，再加入上述重组质粒，匀化后加入聚乙烯醇溶液，再次匀化，所得产物搅拌后冷冻干燥而制成。

纳米粒制剂中质粒p^UC-AFPlb，p^EGFP和p^NGVL-TK＝1∶1∶1分子比。

纳米粒制剂匀化用旋涡混合器或探头超声仪或细胞粉碎机，搅拌用搅拌器。

纳米粒制剂中聚酯载体为50～200毫克，吐温为10～100毫克，有机溶剂为1～5毫升，重组质粒为50～200毫克，聚乙烯醇溶液浓度为3～9％。

纳米粒制剂所用聚乙烯醇溶液中溶解了二氯化钙，二氯化钙的溶解浓度为0.5～1.5％。

纳米粒制剂用探头式超声仪或细胞粉碎机匀化，第一次匀化时再为3～7秒，第2次匀化时间为3～7秒，所得产物用磁力搅拌器搅拌4-6小时。

纳米粒制剂用旋涡混合器匀化，第一次匀化时间为2-4分钟，第二次匀化时间为1-3分钟，所得产物用磁力搅拌器搅拌4-6小时。

纳米粒(Nanoparticle，NP)是一类由天然高分子物质或合成高分子物质制成的10-1000nm的载药小球，大量的研究证明NP具有明显的靶向性和体内延效作用。本发明使用的是低毒的和生物相容性好的聚酯类载体材料。

本发明首先制备了以TK基因作为治疗基因，增强绿色荧光蛋白(Enhanced green flueorescent protein，EGFP)作为报告基因，并以α-甲胎蛋白(α-Fetoprotein，AFP)启动子/增强子作为目的基因调控序列的新型重组质粒(p^EGFP-ATK)，再以纳米粒包裹此重组质粒。

这种纳米粒静注后不仅可保护所载基因不被核酸酶降解还可通过控制纳米粒大小使所载基因首先浓集于肝脏，所携自杀基因只在特异性产生AFP的未分化和低分化的肝癌细胞中表达，加入诱导药物后只选择性杀死肝癌细胞，而不影响正常细胞，EGFP因其本身具荧光发光特性，作为重组质粒的报告基因，适合以流式细胞仪和荧光显微镜检测。综上所述，本发明有如下优点：

本质粒由TK治疗基因，EGFP报告基因和AFP启动子/增强子调控序列组成，本质粒只在特异性产生AFP的未分化和低分化肝癌细胞中表达，具有更好的特异性，且能被方便检测。