[发明专利]重组耻垢分支杆菌其制备及在治疗膀胱肿瘤药物中的应用

权利要求书

1、一种重组耻垢分支杆菌，其特征是：a.由耻垢分枝杆菌和由分枝杆菌表达质粒，人结核杆菌热休克蛋白70启动子cDNA，堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽cDNA及人白细胞介素-2cDNA组成的分枝杆菌穿梭表达载体构成；b.经基因工程重组后的耻垢分支杆菌，其特性不变，同时在含有卡那霉素抗性的Lemco broth培养基中可以稳定。即为本重组菌生长传代，表现为黄白色菌落，通过蛋白印迹分析法和ELLSA免疫分析法检测到其中的IL-2蛋白表达。

2、一种制备重组耻垢分支杆菌的方法，其特征在于：

第一步，将含有堪萨斯分枝杆菌和编码基因的重组质粒pIJK-1，根据其全长序列，设计一对引物分别带有NcoI和XbaI酶切位点，从中扩增出堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因，将含有人结核分枝杆菌hsp70的启动子和编码基因重组质粒pY6013，经NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信号肽基因构建4.5kb的重组质粒pY-α；

第二步，重组质粒pHIG53含有人白细胞介素-2编码基因，PCR扩增不含信号肽的人白细胞介素-2编码基因片断；重组质粒pY-α用相应的限制性内切酶HindII和XbaI酶切消化，将目的基因片段和载体进行连接和转化，构建成中间克隆载体pY-α-IL-2；

第三步，将分枝杆菌质粒pRR3用限制性内切酶ScaI消化，并用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重组质粒pY-α-IL-2用限制性内切酶EcoRI消化，与载体pRR3进行连接和转化，构建成4.54kb大小的分支杆菌穿梭表达载体pR-α-IL-2；

第四步，利用电穿孔转化法将穿梭表达载体pR-α-IL-2转入耻垢分枝杆菌M.smegmatis mc² 155中，构建了表达人IL-2的分枝杆菌菌株，即重组耻垢分枝杆菌。

3、重组耻垢分枝杆菌在用于制备膀胱肿瘤药物上的应用。