[发明专利]重组耻垢分支杆菌其制备及在治疗膀胱肿瘤药物中的应用

说明书

(一)、技术领域

本发明涉及生物技术制品及其制备方法及在制备药物上的用途，具体涉及重组耻垢分枝杆菌疫苗、其制备方法、及在制备用于治疗浅表型膀胱肿瘤、原位癌、无法手术治疗的晚期肿瘤及膀胱肿瘤术后防治复发等药物中的应用。

(二)、技术背景

众所周知膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，其主要特点是发病率、复发率高、恶性程度低。据统计目前的发病率可高达30/10万，初次发病时70-80％的膀胱肿瘤为浅表乳头状瘤，但单纯手术切除复发率达50-92％。每次复发其病理分级增高，最终发展为浸润性癌转移而致死。目前，用于防治膀胱肿瘤的卡介苗的有如下缺点：1.临床上应用卡介苗给药剂量大(65-130mg/次)2.用药次数多3.副作用多：50％以上的病人伴有尿路刺激症状、血尿和发烧等副作用，少数病人还可发生尿道结核、膀胱结核、甚至全身粟粒性结核，严重时可导致病人死亡4.生长周期长，制备困难，生产成本高。卡介苗生长周期为一个月。IL-2也具有防治膀胱肿瘤的作用，但费用高。

耻垢分枝杆菌(M.smegmatis mc² 155)是一种已知的快生长型分枝杆菌，它是从土壤中分离出来的非致病性分枝杆菌，在显微镜下通过抗酸染色可以观察到红色杆状或短棒状细菌。目前未见有耻垢分枝杆菌在药学上应用的文献报道及应用，也未见有耻垢分枝杆菌重组基因疫苗及应用的文献报道。

(三)、发明的内容

本发明所要解决的技术问题之一就是针对现有技术存在的以上不足而设计一种重组膀胱肿瘤基因疫苗。该疫苗利用来源于土壤的非致病性耻垢分支杆菌所具有的免疫原性强、无毒副作用、无致病性、繁殖周期短、生产成本低的特点，采用分子生物学技术，构建了分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒，将IL-2基因导入到分枝杆菌中，研制了一种安全有效、无毒副作用、生产成本低廉的新型膀胱肿瘤基因疫苗。本发明所要解决的技术问题之二是提供一种制备所述重组耻垢分支杆菌。本发明所要解决的技术问题之三是提供重组耻垢分支杆菌在药学上的应用。

本发明解决所述技术问题之一是采用这样的技术方案实现的：即一种重组耻垢分支杆菌，其特征是：a.由耻垢分枝杆菌和由分枝杆菌表达质粒，人结核杆菌热休克蛋白70启动子cDNA，堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽cDNA及人白细胞介素-2cDNA组成的分枝杆菌穿梭表达载体构成；b.经基因工程重组后的耻垢分支杆菌，在含有卡那霉素抗性的Lemco broth培养基中可以稳定生长传代，即为本重组菌；表现为黄白色菌落，通过蛋白印迹分析法和ELLSA免疫分析法检测到其中的IL-2蛋白表达。

本发明解决所述技术问题之二是通过这样的技术方案实现的，即一种重组耻垢分支杆菌的制备方法，其特征在于：

第一步，将含有堪萨斯分枝杆菌和编码基因的重组质粒pIJK-1，根据其全长序列，设计一对引物分别带有NcoI和XbaI酶切位点，从中扩增出堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因，将含有人结核分枝杆菌hsp70的启动子和编码基因重组质粒pY6013，经NcoI和XbaI酶切消化后，加入α抗原信号肽基因构建4.5kb的重组质粒pY-α；

第二步，重组质粒pHIG53含有人白细胞介素-2编码基因，PCR扩增不含信号肽的人白细胞介素-2编码基因片断；重组质粒pY-α用相应的限制性内切酶HindII和XbaI酶切消化，将目的基因片段和载体进行连接和转化，构建成中间克隆载体pY-α-IL-2

第三步，将分枝杆菌质粒pRR3用限制性内切酶ScaI消化，并用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸化，重组质粒pY-α-IL-2用限制性内切酶EcoRI消化，与载体pRR3进行连接和转化，构建成4.54kb大小的分支杆菌穿梭表达载体pR-α-IL-2；

第四步，利用电穿孔转化法将穿梭表达载体pR-α-IL-2转入耻垢分枝杆菌M.smegmatis mc² 155中，构建了表达人IL-2的分枝杆菌菌株，即重组耻垢分枝杆菌。

本发明所要解决的技术问题之三是提出重组耻垢分枝杆菌在制备治疗膀胱肿瘤药物上的应用。

本发明具有安全有效，造价底，使用方便，无痛苦、无毒副作用，对防治膀胱肿瘤的复发疗效好等特点。

(四)、附图说明

本发明有如下附图：

附图1为重组耻垢分枝杆菌的构建示意图；

附图2为重组耻垢分枝杆菌免疫反应柱状比较图；

附图3为重组耻垢分枝杆菌免疫反应柱状比较图；

附图4为重组耻垢分枝杆菌免疫反应毒性线段比较图；

附图5为T24细胞增值反应柱状比较图；