[发明专利]用于构建T载体的DNA序列及用该序列制备T载体的方法

说明书

                        技术领域

本发明涉及一种用于构建T载体的DNA序列、含有该序列的载体以及用该序列制备T载体的方法。

背景技术

“T/A”克隆法(Clark 1988；Holtonh and Graham 1991；Marchuk et al.1991；Mead et al.1991；Hu1993；Zhou et al.1995)是伴随着PCR技术而发展起来的一种克隆方法。由于许多耐热性DNA聚合酶如Taq酶等的非模板依赖的末端转移酶活性可以在几乎任何双链DNA分子的3’端加上一个突出的“A”(Clark 1988；Zhou et al.1995)，因此人们开发出一种3’端带一突出“T”的特殊载——T载体，以用于克隆Taq酶扩增的PCR产物或其它以Taq酶做A-tailing操作的线性DNA片段。目前用到的T载体一般是商品化的载体，其构建策略不同厂商各有不同(Holton and Graham 1991；Marchuk etal 1991)，主要分为两类：

1.在高浓度的dTTP的存在下，被产平末端的内切酶消化后的载体与Taq酶温育，由于Taq酶在不存在dATP的情况下有相对良好的3’末端加“T”能力，因此可以在线性化载体的平滑末端的3’端添加一个“T”，制成T载体。

2.在ddTTP的存在下，具平滑末端的的载体与末端转移酶温育，由于ddTTP不含3’-OH，因此末端转移酶只能在载体的3’端加上一个“T”，构成T载体。

以上方法制得的T载体由于有生产厂商的严格质量控制，其效率可达70％或更高(PromegaCatalog&Technical Reference 2000-01)，可以满足常规的克隆操作。但由于其操作步骤较多，质量不易控制，因此只应用于几种常见载体如pUC18，pGEM等，而且由专业的公司来生产。

限制性内切酶HphI、XcmI的识别序列和切割位点分别是GGTGA(N8/N7)和CCA(N5/N4)TGG，它们的一个共同特点是其切割位点附近的碱基是简并的，并且靶序列被切开后产生3’末端的单个核苷酸突出，这一特性为T载体的开发提供了素材(Mead et al.1991)。将两个靶序列反向重复的插入载体，并且将切割位点上游的第一个碱基设为T，便得到一前T载体，相应的酶切处理前T载体可得到含3’末端突出一个T的成熟T载体。已尝试过用这一方法得到T载体以用于克隆PCR产物的限制性内切酶有XcmI、HphI、Eam11051或其同裂酶AspEI等(Mead et al.1991；Ichihara andKurosawa 1993；Testori et al.1994；Cha et al.1993；Ido and Hayami 1997；Arashi-Heese et al.1999；Schutte et al.1997；de Vries 1998；Borovkov and Rivkin 1997；Testori and Sollitti 1997)。但值得指出的是，目前用这一方法制作T载体其应用效果都不甚理想，一个主要的原因是这类产末端单核苷酸突出的限制性内切酶其切--连--切(cut-ligate-recut)指标较差，尤其是连接的效率很低，如XcmI的切--连--切指标为95％--20％--95％(NEB Catalog&Technical Reference 2000-01)，这就使得克隆的效率过低而在实际应用中不被接受。HphI是这类酶中的一个例外，其切--连--切指标为95％--75％--95％(NEB catalog&Technical Reference 2000-01)，基本可以满足常规的克隆操作的需要，因此理论上是生产这种T载体的首选(Mead et al.1991)，但由于其识别序列只有五个核苷酸，几乎所有的载体自身都带有一个或多个它的识别序列，因此它的实际应用就不具普遍意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能兼顾上述切--连--切指标和识别序列长度的用于构建T载体的DNA序列及含有该序列的载体和采用该序列构建T载体的方法。