[发明专利]一种建立人/山羊造血干细胞异种移植模型的方法

说明书

技术领域

本发明属生物细胞技术领域，具体涉及一种建立造血干细胞异种移植模型的方法。

背景技术

干细胞是一种未分化的、长期存在并能向各个方向分化的细胞。其特征为未分化且不具有特异性，能够自我更新以及产生一种或多种特异性并具有特殊功能的细胞。近年来，对于干细胞的研究已成为生命科学领域的一个热点。特别是造血干细胞(hematopoietic stemcells，HSC)移植已成为临床上治疗众多恶性肿瘤和遗传性疾病的有效手段^[1]，然而在发展这种治疗方法的同时，至少有两点是值得注意的，其一是如何获得大量可供移植的HSC，其二是HSC在体外和体内分化程度的控制。有研究曾经试图应用体外长期培养HSC技术来扩增干细胞及研究其分化的控制，但是结果存在争议。

人类和哺乳动物的HSC移植实验表明，只有在宿主处于免疫耐受或免疫屏障尚未被激活时，移植方能成功。在胎儿发育的早期，免疫器官尚未发育成熟，处于免疫幼稚期，故是HSC移植的合适受体。Zanjani等成功地将从人胎肝分离的HSC移植于胎绵羊，获得人HSC在绵羊体内长期存活。

发明内容

本发明的目的是提供一种建立人/山羊造血干细胞异种移植模型的方法，可获得人/山羊造血干细胞嵌合模型。诣在个体水平水探讨HSC移植后的生物学现象，为SHC在体内的扩增及分化等变化提供技术平台。并可开辟HSC宫内移植研究的新途径，不仅可为治疗疾病提供理论和技术依据，还可提高HSC移植的成功率。

本发明从人脐血分离获得人HSC，注射到胎山羊体内，成功地建立了人/山羊造血干细胞异种移植模型。在实验组的50头移植山羊中，35头山羊移植成功，并显示人HSC扩增至1000-10000倍，更有意义的是，移植于山羊体内的人造血细胞已稳定保持其表型达10个月以上，并处于不完全分化状态。而对照组40头非移植山羊的血液中却没有人造血干细胞所特有的CD34⁺细胞，两者之间的差异极显著[P＜0.01]。本发明方法技术方案及步骤如下：

1、移植模型构建的基本路线：

首先收集新鲜人脐血，然后分离出人HSC，将分离的HSC移植入胎山羊腹腔中。整个过程在8-16小时内完成。待胎羊分娩后3个月、6个月、10个月分别抽取静脉血进行检测，验证山羊体内是否嵌合有人HSC及其含量和分化程度。

2、移植模型构建的具体步骤：

(1)获得新鲜的人脐血。

(2)所得人新鲜脐血首先用NycoPrepTM(1.077g/mL，Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)梯度离心分离脐血中单个核细胞，然后用“人原始祖细胞富集鸡尾酒”(Human PrimitiveProgenitor Enrichment Cocktail，Stemcell Technologies，Vancouver，Canada)试剂盒进一步分离获得人HSC(CD34+CD38-Lin-细胞)。

(3)将分离获得的人HSC移植于胎山羊，胎龄为55-65天。术前母山羊需禁食24小时，然后肌肉注射麻醉剂“846”(0.01mL/kg，中国军需大学产品)，剖腹暴露子宫后，通过子宫壁直接向胎羊腹腔内注射人HSC，注射剂量为每头HSC1-5×10⁵。关闭母体腹腔后，静脉推注“清醒剂”(中国军需大学产品)促使山羊恢复知觉。

3、检测构建模型：

在50头移植的胎山羊中活产39头。待胎羊分娩后3个月、6个月、10个月分别抽取静脉血进行检测，测定山羊体内是否成功移植入人HSC即是否嵌合有人HSC，并检测山羊体内人HSC的量及其HSC的分化程度。

(1)进行FACS分析：

在鉴定人/山羊造血干细胞移植模型的体内是否嵌入人的HSC以前，比较分析正常山羊和人两者的细胞对鼠抗人单抗结合能力的差异，以找出对人细胞特异而对山羊细胞不特异的鼠抗人单抗用于人/山羊模型的FACS比较分析。

本发明采用材料来源：PE(phycoerythrin)和FITC共价标记的鼠抗人CD抗原，GPA和HLA抗原的单克隆抗体购自美国B.D.公司，流式细胞仪为美国B.D.公司产品。本发明中FACS的分析步骤按美国B.D.公司的操作指南进行，通过鼠抗人单抗对正常山羊和人两者之间的细胞结合能力的比较分析。