[发明专利]一种定量检测趋化因子表达水平的方法

权利要求书

1.一种定量检测趋化因子表达水平的方法，其特征是通过构建含

有特定内参照质粒PAL-2-IS.4，以同一对引物在同一反应管中

竞争扩增，建立对趋化因子的表达水平的竞争性定量检测方法。

2.按权利要求1所述的方法，其特征是所述的趋化因子为LARC。

3.按权利要求1所述的方法，其特征是所述的内参照质粒

PAL-2-IS.4与LARC特异性引物互补序列，该质粒DNA内含比

野生型sLARC大42bp、其5’和3’末端序列与LARC基因的5’和

3’末端序列同源的特定基因序列。

4.按权利要求1所述的方法，其特征是按以下步骤进行：

a)从HepG₂2.2.15细胞中扩增得目的基因LARC，以T₄DNA连接酶

克隆到载体pBS-VH62-ANK质粒中，以P₂/P₃为引物，从新质粒

中扩增出324bp的目的基因LARC；再以EcoR I对质粒行酶切，

目的基因插入到空载体pBS-VH62-ANK中构建成PAL-2质粒，

其中P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG₂2.2.15；

b)构建及鉴定PAL-2-IS.4质粒，取人工合成的一对互补的42bp

外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，以连接

酶克隆到PAL-2中，得质粒PAL-2-IS后，以P₂/P₃为引物对质

粒进行鉴定，经测序确认新质粒已插入了IS片段，得内对照

质粒PAL-2-IS.4

c)建立检测LARC表达的竞争性RT-PCR技术，以PAL-2与

PAL-2-IS.4共扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外成像凝胶

处理系统扫描分析，根据各扩增条带的光密度值，用光密度比

值法，得直线回归方程y＝ax+b，

d)验证本发明方法的准确性。1)检测HBV不同感染状态下LARC

表达水平，2)检测正常及慢性肝炎活检肝标本中LARC表达

量。

5.按权利要求4的方法，其特征是所述的P₂/P₃引物，其中P2序

列：5’GTC GAA TTC CAT TCT AGA AAA GCC ACA G 3’，P3

序列：5’CGG AAT TCC CAT GTG CTG TAC CAA G 3’。