[发明专利]一种定量检测趋化因子表达水平的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种定量检测趋化因子LARC表达水平的方法，和构成本发明方法的关键内对照质粒。

背景技术

随着PCR(Polymerase Chain Reaction)技术在基础研究、临床诊断等各个领域的广泛应用，人们逐渐意识到仅仅停留在PCR的定性应用上的诸多局限性。生命科学研究，已超出了最初“有/无”的简单的定性范围，而需要更精准的“多/少”的定量概念。以HIV、HBV、HCV等病毒研究为例，定量PCR检测病毒基因，可协助判断潜伏的感染者及无症状携带者的情况，并可从测定结果来判断药物的治疗效果、推测复发的可能性；至于mRNA的RT-PCR定量更能进一步反映病毒的转录水平、活动性、复制性等指标。

LARC(Liver and Activation-Regulated Chemokine)是1997年日本学者Hieshima发现并鉴定的一个新的CC类趋化蛋白。LARC在生理状态下在人肝脏中有一定水平的表达，是肝脏中的一看家趋化蛋白；LARC可趋化活化T淋巴细胞、记忆T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫活性细胞表面，在乙肝病毒感染的病毒特异性细胞免疫，尤其是CTL杀伤肝细胞、清除病毒的免疫应答过程中有重要的角色。LARC的表达水平与其相关疾病如乙型肝炎的免疫状态、转归、预后等的判断具有重要意义。由于LARC与大多数趋化蛋白一样，具有瞬时分泌、含量微弱、局部表达、而不进入循环等的特点，无法用传统的定量方法对其进行精确的定量，所以，需要建立一个良好的分子水平的定量系统，对LARC转录及翻译进行较为准确的定量，用较为精准的量化概念反映该分子的表达水平。

目前常用的对趋化因子进行定量的方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学实验和定量RT-PCR/PCR法等。其中ELISA方法较为迅速简便，但需要体液如血清、分泌物等为检测对象，且精确度和敏感性较差，而趋化蛋白恰恰又是一种分泌水平相对微弱的蛋白质，这势必限制了该方法的应用。免疫组化实验能直观地对趋化蛋白的表达进行定位、定量研究，但对抗体的要求较高、且仅局限于对一些胞内分泌型趋化蛋白的检测，而大多数趋化蛋白往往具有广泛弥散性分泌的特点。定量PCR技术是根据PCR的产物量来推断其原始模板量的方法。常用的定量方法主要有外标法(external standard)、内标法(internal standard)和实时荧光法(real time)三种。外标法具有操作简便、快速等特点，但由于PCR反应是一指数变化过程，反应过程中任一参数如模板起始量、引物浓度、DNA聚合酶活性、反应温度、循环时间、循环数等的微小变化都会显著改变终产物的量，反应前几个循环的不均一性、各反应管不同的升降温效率等将造成无法避免的管间差异，使定量结果的可靠性大为降低。内标法是在定量系统中设立内参照，将参照基因与待测基因在同一反应管内共同进行扩增，这样可在很大程度上消除“管间差异”带来的误差。

发明内容

本发明的目的是建立能对LARC转录及翻译水平进行相对精确的定量cQRT-PCR系统，用较为准确的量化概念反映LARC的表达水平。

本发明通过构建含有与LARC特异性引物互补序列的特定内参照质粒，以同一对引物在同一反应管中竞争扩增LARC，从而对LARC的表达水平进行定量，建立了定量检测趋化因子LARC表达水平的cQRT-PCR技术。并通过对已知量的LARC水平、HBV不同感染状态下体外培养细胞及病人活检肝组织标本中LARC表达量的研究和测定，验证了本方法具备了较高的可靠性和准确性。

本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：