[发明专利]以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种基因检测技术，具体地说，涉及以Taq酶(耐热DNA聚合酶)对DNA和RNA病原进行同步PCR(聚合酶链式反应)快速扩增检测的方法。

二、背景技术

基因研究带动了20世纪整个生命科学的迅速发展，在21世纪仍将继续推动生命科学研究向纵深发展。基因检测不仅对生物学研究至关重要，而且对临床医学、药学、农业技术、环境监控、法学鉴定等领域也具有极其重要的意义。

现行的DNA病原的PCR检测方法多为将样品前处理后，经过碱、表面活性剂、蛋白酶等降解蛋白质外壳、细胞壁、细胞膜等后，用酚、氯仿-异戊醇抽提分离废蛋白，上清加醇类和无机盐沉淀核酸以提取核酸DNA或RNA，然后经过PCR扩增后经过电泳或杂交检测扩增产物，这一过程大约耗时8～36小时。

1、下面以乙肝病毒(HBV)的血清PCR基因检测为例：

取待检血清100μl加入等体积的蛋白酶K(2mg/ml蛋白酶K溶于0.04molTris、0.01mol EDTA和1％SDS预孵育40℃30分钟)在40～56℃消化1～3小时，用等体积饱和酚提取1～3次，再用等体积氯仿-异戊醇(24∶1)提取1～3次；高速离心(8000～16000rpm)，取水相加入1/10体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠缓冲液和2～3体积的无水乙醇充分混合，于-20℃放置2小时以上；然后高速离心(8000～16000rpm)回收DNA，沉淀用75％冰冷乙醇离心清洗1～2次，真空干燥，溶于TE缓冲液。取5～10μl进行PCR扩增反应，电泳后观察结果。

2、至于RNA病原的检测，模版的制备条件更为苛刻，它需要一套新的不同于DNA病原的试剂系统和操作程序，以丙肝病毒(HCV)的血清RT-PCR检测为例：

取待检血清100ul依次加入2倍体积的GSL消化液(4mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠PH7.0、0.5％N-Lauroylsarcosine)、2倍体积用Tris-HCl pH8.0饱和的酚、等体积的水饱和的氯仿-异戊醇，每加一种试剂均应混和充分，反应体系中还要加入RNA酶抑制剂；高速离心取水相，加入1/10体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠缓冲液，再加等体积异丙醇于-20℃放置2小时以上；然后高速离心回收RNA，沉淀用75％冰冷乙醇离心洗涤1～2次，真空干燥，溶于TE缓冲液。取5～10μl用于逆转录PCR扩增，添加RNA酶抑制剂后，在逆转录酶(AMVRT)的作用下，42～56℃.温浴30～60分钟，逆转录合成cDNA链，再进行PCR扩增，即RT-PCR.，然后电泳观察结果。

由上述两个例子可见，传统方法反应体系和操作程序极为复杂，难于控制，容易出错，而且要耗费大量时间，浪费大量试剂，极不经济。

然而，现实的情况是，有些病人的临床症状虽然相似，但引起疾病的病因或病原不同，有的是DNA病原引起，有些是RNA病原引起，有些既有DNA病原也有RNA病原，还有的需要同步检测多种DNA和RNA病原基因。如果根据现有资料使用引物探针，一种一种地分别进行PCR扩增检测未免盲目，无异于守株待兔，浪费了大量时间和试剂，病人也因得不到及时的诊断结果耽误了治疗。

三、发明内容

本发明的目的就是克服现有上述对DNA和RNA病原进行检测的方法的缺点和不足，而提出一种以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法。

本发明的目的是这样实现的：其采用的是蛋白质裂解试剂，该蛋白质裂解试剂组成为1％～10％的十二烷基硫酸钠(SDS)、2～20％NP-40、1～10％吐温-20等表面活性剂与Tris或磷酸缓冲液的两两组合，再加入RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯(DEPC)；取裂解试剂与病理标本共同煮沸5～30分钟，离心取上清即可同步提取病毒核酸DNA和RNA，以此上清为模板，无需加入逆转录酶，利用Taq DNA聚合酶本身的聚合酶活性和逆转录活性(其作用类似逆转录酶，活性温度一般为65℃～68℃，在Mn²⁺存在时，其逆转录活性更高的特性)，以提取的病毒核酸为模板直接进行PCR扩增，得到所需的各种目的核酸片断，经过电泳或杂交认定后达到基因检测目的。它可以为DNA病原和RNA病原基因进多重PCR(一次反应，加入多对引物，扩增多种基因)扩增后，同步检测提供一种迅速简便的方法。检验流程为模板制备、PCR扩增、检测。

本发明具有以下优点和积极效果。