[发明专利]ATP再生反应系统、利用该系统的腺苷酸的检验方法、RNA检测方法和ATP放大方法

说明书

                     技术领域

本发明涉及ATP再生反应系统，以及利用该系统的腺苷酸的检验方法、RNA检测方法以及ATP放大方法

更详细地讲，本发明涉及在动植物的代谢和生物合成系统中生成的ATP、ADP、AMP或它们的混合物等所谓的腺苷酸的检验方法，本发明可应用于例如通过生物发光来测定ATP(腺苷三磷酸)，在食品加工厂等中通过检测肉眼看不见的微生物来检验清洁度，以及测定食用肉、鲜鱼、蔬菜等食物的鲜度。

本发明还涉及用于检测核糖核酸(RNA)的，特别是用于检测存在于高等生物细胞中的与蛋白质合成有重要关系的信使核糖核酸(mRNA)、核糖体核糖核酸(rRNA)、转运核糖核酸(tRNA)的方法。

另外，本发明还涉及能使动植物的代谢和生物合成系统中生成的ATP量级联放大的方法，通过利用该方法检测生物发光，可以检测出以往不能检测的极微量的ATP，所以可应用于在食品加工厂等中通过检测肉眼看不见的微生物来检验清洁度，以及测定食用肉、鲜鱼、蔬菜等食物的鲜度。

                     背景技术

ATP(腺苷三磷酸)是活生物的指标。因此，通过将来自微生物的ATP用于生物发光，可进行以光作为指标的微生物的卫生检验(例如特公平6-34757号公报、特许第1911659号)。然而，对于微量微生物，由ATP产生的生物发光不足以进行上述检验。

例如，将作为催化剂的酶(例如来自发光昆虫的荧光素酶)作用于微生物污染的指标成分ATP时，已知可以产生荧光发光。然而，在上述荧光发光的测定中，存在着发光的稳定性差、发出的光在非常短的时间内就消失的缺点。因此为了获得灵敏度和精度，需要对反应时间进行严密控制，以及为了捕获短时间内就会消失的发光，需要特别的光度计等。

特开平8-47399号公报中公开了特征为“在测定荧光素酶作用下产生的生物发光的方法中，在共存多磷酸化合物或其盐、以及巯基化合物的条件下进行生物发光反应”的技术。利用该技术，可获得生物发光的稳定性等新型效果，进而有可能通过使用常规光度计进行生物发光的测定，并具有提高普及率的效果。上述特开平8-47399号公报中使用的多磷酸化合物是三多磷酸、焦磷酸等三磷酸、二磷酸或它们的盐。

然而，上述特开平8-47399号公报公开的方法由于没有ATP新的再生系统，所以存在着随着ATP的消耗，发光随时间推移而衰减的缺点。因此，为了使发光量不衰减并持续稳定，人们不得不进行底物浓度、氧浓度、pH、温度的研究。

另一方面，特开平9-234099号公报中公开了通过生物发光法对环AMP进行定量的方法。

该方法的特征在于，包括用3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶对环AMP进行水解，进而在反应体系中生成AMP的“反应1”；在镁离子、微量ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于该AMP，使AMP转换为ADP的“反应2”；在镁离子、磷酸烯醇式丙酮酸存在下，将丙酮酸激酶作用于该ADP，使ADP转换为ATP和丙酮酸的“反应3”；在荧光素、镁离子(或其它金属离子)以及溶解氧的存在下，将荧光素酶作用于ATP，进而产生发光的“反应4”；通过测定“反应4”中产生的发光量，对环AMP进行定量的方法(Methods in Enzymology 38，62-65；1974)。

然而，该方法由于将由环AMP转换的AMP转换为ADP后，在磷酸烯醇式丙酮酸存在下，再将丙酮酸激酶作用于该ADP并最终生成ATP，所以存在以下问题。即，一分子的磷酸烯醇式丙酮酸中只含有一个磷酸基(-PO₃^--)，因此由ADP向ATP的转换不充分，为了大量再生ATP，必须大量补充磷酸烯醇式丙酮酸，所以不经济。

另外，磷酸烯醇式丙酮酸具有非常不耐热且容易分解的性质，将餐饮场所等刚煮熟的食物作为被检验物时，将含有磷酸烯醇式丙酮酸的试剂加到被检验物中的话，磷酸烯醇式丙酮酸就会分解，进而有可能导致由ADP向ATP的转换不充分(对于产品温度处于60～70℃左右的被检验物，可以使用耐热性酶进行测定)。就是说，有可能导致由ATP产生的荧光发光稳定性差且发光在非常短时间内消失的问题。

另外，被检验物中一般都存在着数种细菌，如果在该细菌中存在分解磷酸烯醇式丙酮酸的酶，就有可能导致无法补充磷酸，以及由ADP向ATP的转换不充分的问题。