[发明专利]微生物快速分型方法及所用试剂盒

权利要求书

1.利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)的细菌快速分型方法；该方法 在7-13小时内进行，包括在CHEF(Contour Clamped Homogeneous Electric Field)系统的微型槽内进行细菌DNA限制性片段的分离和 通过在一组已知的理论公式中代入DNA大小‘L’、电场‘E’、缓冲液粘 度‘η’和脉冲时间计算所述片段在不同脉冲时间tp时在1.5％琼脂糖 凝胶、0.5×TBE缓冲液中的DNA迁移‘D’，其中0.5×TBE缓冲液为 44.5mMTris、44.5mM硼酸、1mM EDTA、pH 8.3，且该已知理论公式 表示为D=Σr=1ndr·Npr,]]>其中‘d’表示每次脉冲的迁移，计算为 d_r＝vr·tp_r·Γ_r(tp_r-tr)+vm·(tp_r-tr)·[1-Γ_r(tp_r-tr)]，vr是DNA重定向 速度，计算为vr＝0.0207[QE^1.45/(8πηL^1.35)]，‘vm’是重定向后的DNA速 度，计算为vm＝0.665[QE^1.76/8πηL^1.08]，‘tr’是DNA重定向时间，计 算为tr＝0.134(L^1.14/vr)^0.926；如果(tp-tr)≤0则Γr(tpr-tr)＝1，而如果 (tpr-tr)>0则Γr(tpr-tr)＝0，其中缓冲液粘度‘η’计算为缓冲液温 度的函数，‘n’是脉冲时间斜坡数，‘Np’是脉冲数；该方法包括： a)如下制备大肠杆菌、铜绿假单孢菌或金黄色葡萄球菌细胞的固定 化完整DNA的步骤：

i)在仅由化学试剂组成的最多5种不同的溶液中依次温育各细 菌种的细胞和DNA分子，所述溶液选自以下7种：

-0.15M NaCl盐和0.01M金属螯合剂EDTA，pH 8.0，该溶液称 为溶液1，

-0.15M NaCl，该溶液称为溶液2，

-悬浮在0.15M NaCl溶液中的1.5％低熔点琼脂糖，该溶液称为 溶液3，

-悬浮在由0.15M NaCl和0.01M金属螯合剂EDTA组成且pH为 8.0的溶液中的1.5％低熔点琼脂糖，该溶液称为溶液4，

-0.1M金属螯合剂EDTA，浓度均为1％的2种阴离子去污剂十二 烷基肌氨酸钠和Nonidet P-40，和0.01M Tris碱，pH 8.0，该溶 液称为溶液5，

-0.1M金属螯合剂EDTA，浓度均为1％的2种阴离子去污剂十二 烷基肌氨酸钠和Nonidet P-40，0.01M Tris碱，和4M脲，pH 9.5，该溶液称为溶液6，

-0.1M金属螯合剂EDTA和0.01M Tris碱，pH8.0，该溶液称 为溶液7，

ii)用于灌注包含细菌细胞的琼脂糖微胶块的柔软模具；该模具 为聚硅氧烷的薄片，并盖有玻璃盖子；该薄片厚达0.5cm，并在其一 个表面印有多个大小为0.3cm、深度为0.03至0.1cm的方形凹槽， 琼脂糖-细菌细胞混合物在凹槽中固化，形成所述大小的微胶块，所 述模具足够柔软，能够弯曲而从中分离出所述的微胶块，并且能在灭 菌后重新使用，所述的模具和盖子进行组装用于灌注包含固定化的细 菌细胞的微胶块，

iii)灌注含有所述细菌种之一的被包埋的细胞的微胶块、从模具 上分离所述微胶块、以及通过所述在仅由化学试剂组成的最多5种溶 液中的依次温育来处理所述细胞和DNA分子的步骤；

b)在微型槽中分离所述细菌种的DNA限制性片段之前进行的计算步 骤，借助该步骤选择出miniCHEF运行的最适电泳条件，该步骤由一 计算方法完成，其包含：

i)针对电场1-20V/cm和温度4-30℃输入细菌DNA限制性片段 的‘d’、‘tr’、‘vr’和‘vm’的数据设置，这些数据 设置值是通过在描述‘tr’、‘vr’、‘vm’和‘d’的已 知理论公式组中代入DNA大小、电场和温度而获得的，

ii)计算斜坡脉冲的持续时间，或最有效分离DNA分子的脉冲持 续时间系列，

iii)计算总的运行时间，或针对步骤(ii)计算的脉冲持续时间系 列计算最有效的电泳运行时间，

iv)针对所述的最适电泳条件或最有效脉冲持续时间斜坡和运行时 间计算条带示意图，该图是此方法的计算结果，其特征在于条带 以按DNA迁移分开的不同颜色的线绘制；

示意图中每一颜色表征特定大小的限制性片段；由此明确的颜色 代码确认了片段的大小，

根据几个步骤进行每一计算；由几项形成序列或斜坡，其中一项 是脉冲持续时间‘tp’，一项附有给出最有效运行持续时间的相应脉 冲数‘Np’。