[发明专利]微生物快速分型方法及所用试剂盒

说明书

说明性回溯

国际专利分类号：C12N 1/00

技术领域

本发明涉及分子生物学。特别提供了方法。该方法包括微生物快 速分型的方法和程序的应用、以及试剂盒。待分型的微生物可以是酵 母、寄生虫以及革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。在CHEF或TAFE系统 的微型装置中，利用脉冲场微型凝胶电泳进行微生物分型。

发明背景

过去数年中，传染性疾病增多，并出现多药耐药性(multi-drug resistance)微生物(Acar J和Courvalein P pp 50-53；Aubry- Damon H和Andremot A，pp 54-55；Trieu-Cout P和Poyart C，pp 62-66，in’La Recherche’，vol 314，1998)。

传染性疾病的爆发，需要对致病微生物进行分型。分型是指将特 定属的不同种微生物分类为不同的亚群或亚类的方法(Busch U和 Nitschko H，J Chromatogr B，1999，722：263-278)。从流行病学 观点来看，分型对于识别传染病爆发、确定健康中心的医院源性病原 体的传播途径以及检测传染源是重要的。分型也用于鉴定新毒株和监 测接种程序。如果满足以下标准，则认为分型方法是适当的(Maslow JN等人，Clin Infect Dis，1993，17：153-164)：

1.为分析的每个分离物给出明确结果。

2.给出可重复性结果。

3.区分种内无关株。

有几种微生物分型方法，其中一些基于表型特征分析(表型方 法)，其它基于基因型特征分析(基因型方法)。表型方法检测微生物 的表达特征，基因型方法则证明微生物DNA之间的差别。因此，表型 方法的缺点在于，提供遗传背景变化的间接测定。使用基因型方法则 没有该缺点。

脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是 最广泛使用的基因型分型方法之一。该方法据认为是微生物分子分型 的金标准。通过在凝胶中分离受到两个不同方向的电脉冲作用的DNA 分子进行PFGE分型。电泳之后，微生物分离物DNA分子的条带图高 度可重现、有差别，明确地表征其DNA(Oliver DM和Bean P，J Clin Microbiol，1999，37(6)：1661-1669)。另外，能够在单个凝 胶中比较多个分离物的全基因组。因此，PFGE已被认为是最佳的分 型方法(Maslow JN，Mulligan ME和Arbeit RD，Clin Infect Dis， 1993(17)：153-164；Busch U和Nitschko H，J Chromatogr B， 1999(722)：263.278)。PFGE的结果取决于DNA分离应用的实验条件 以及所研究的微生物的属和种。因此，a)如果该微生物具有几条低 于10Mb(1Mb＝1 000 000碱基对)的线性染色体，则获得其染色 体的条带图。该条带谱称作‘电泳染色体组型’。例如，该微生物可 以是酵母、单细胞寄生虫等。

b)如果该微生物具有一个单一的大的环状染色体，则获得该环 状DNA大限制性片段的条带图。这些图称作脉冲型，是在特定的实验 条件下获得的。例如，该微生物可以是细菌，如大肠杆菌 (Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 等。

比较不同菌株的电泳染色体组型，可以对其进行特性鉴定和鉴 别。细菌DNA的限制性片段也是如此。因此，分子染色体组型和脉冲 型均可用于真菌、细菌和寄生虫的比较研究。医学微生物学常规使用 PFGE，使得需要改善其样品制备方法。还需要预先设计充分分离分子 的运行条件，并分析产生的电泳图。

利用PFGE的微生物分型方法一般包含以下步骤和程序：

1)制备样品：在营养液中培养微生物，在凝胶中包埋细胞，获 得固定化、去蛋白的完整DNA分子。

2)设计电泳运行：选择PFGE装置上设定的实验条件，以获得分 子间最好的分离。

3)样品上样凝胶中，进行脉冲场凝胶电泳，以分离DNA分子。

4)分析电泳后得到的条带图，比较不同微生物分离物的结果。

分析当前用于通过PFGE进行微生物分型的装置和程序。

脉冲场凝胶电泳