[发明专利]蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌，还涉及一种蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌的构建方法。

背景技术

蝎毒有复杂的成分和性质而产生多种生理、药理活性，对抗肿瘤、治疗风湿、抗癫痫以及心血管疾病有重要冶疗作用。但是由于蝎毒成分复杂，结构相似，难以分离，许多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低，这些无疑都限制了蝎毒的治疗作用。通过基因工程的方法生产有效的蝎毒成分则变得十分必要。在世界范围内，已经获得蝎毒基因几百条，然而能够成功进行表达产生有效蝎毒成分的基因却仅有十几条。其难点主要是产量太低，无法进行后序工作、形成不可溶的包含体、不能正确折叠成为有活性的蛋白质、对表达宿主有毒或者与宿主不匹配而完全不能表达。用于蝎毒基因成功表达的宿主系统多种多样，有大肠杆菌、杆状病毒、酵母、真核细胞以及烟草、杨树等。这些表达系统各有优劣，而且视不同基因而异。最近，中国专利00112016.6以及张景海等(Zhang JH，Hua ZC，Xu Z，Zheng WJ，Zhu DX，Prep BiochemBiotechnol 2001 Feb 31：49-57)发现了东亚钳蝎抗神经兴奋肽的基因并采用pET28a载体在大肠杆菌BL21中表达生产蝎抗神经兴奋肽，然而其产量不高，且大部分形成包含体，不可溶。而且设计的PCR引物中不含有将表达载体中的多个组氨酸与抗神经兴奋肽分割开的蛋白酶酶切位点，使得表达产生的神经兴奋肽必然是一个含有多个额外组氨酸(His)的融合重组蛋白。这些额外的组氨酸会影响重组肽的结构以至它相关的功能。

发明内容

本发明的目的在于是提供一种蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌，具有抗心律失常活性，可溶，产量高。

本发明的另一个目的还在于提供一种蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌的构建方法。

一种重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(pGEX/BmKIM)CCTCC NO：M201046。含有重组质粒pGEX/BmKIM，此质粒以tac为启动子，具有氨苄青霉素抗性，携带谷胱甘肽转移酶基因，并在此基因下游连接了蝎抗心律失常肽基因，连接处含有小肠激酶酶切位点的基因序列。可以用于生产具有抗心律失常活性的蝎抗心律失常肽。

一种蝎生产抗心律失常肽的方法，包括设计PCR上游和下游引物，用PCR从东亚钳蝎蝎毒cDNA库中扩增抗心律失常肽基因片段，并通过表达载体转化到大肠杆菌。其特征是，设计的PCR引物含小肠激酶酶切位点，用PCR扩增的抗心律失常肽基因片段经过限制性内切酶酶切，克隆到pGEX-5x-1表达载体中，转化到大肠杆菌BL21中获得重组大肠杆菌，从而用于生产可溶的且有活性的重组蝎抗心律失常肽。其构建步骤如下：

a)从构建的蝎毒腺cDNA文库(Xian-chun Zeng，Wen-Xin Li，Shun-Yi Zhu，Fang Peng，Toxicon 2000 38：893-899)中筛选抗神经兴奋肽基因的cDNA序列，在推导的氨基酸序列中，其信号肽区有三个氨基酸的差异，其它区域相同，称此cDNA序列为蝎抗心律失常肽基因：

上述为蝎抗心律失常肽的cDNA序列及推导的氨基酸序列，下划线的部分为信号肽区，阴影部分是蝎毒多肽在体内加工成熟的过程中按照贯例会被切除的部分，加点的区域为引物设计区，加黑字母表示与蝎抗神经兴奋肽不同的氨基酸。根据蝎抗心律失常肽基因序列设计引物进行PCR扩增获得含有限制性内切酶酶切位点序列的蝎抗心律失常肽的基因或基因片段。

b)用限制性内切酶对回收的PCR产物和表达载体pGEX-5x-1质粒分别进行酶切。

c)用T₄ DNA连接酶连接酶切后的蝎抗心律失常肽基因和表达载体，构建重组表达载体。

d)制备感受态大肠杆菌BL21，将连接产物转化入大肠杆菌BL21中，将得到的克隆子通过PCR鉴定后对扦入片段进行测序，测序结果正确的克隆子即为蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌。