[发明专利]液－固萃取体系分离纯化血红蛋白的方法

说明书

                   技术领域

本发明涉及一种用液-固萃取体系从血液中分离纯化血红蛋白的方法。更具体地说，是通过聚乙二醇(PEG)修饰物混合聚合物-盐-水液-固亲和萃取法从血液中提取血红蛋白。

                   背景技术

蛋白质的分离纯化，一般采用萃取法、沉淀法、层析法、电泳法、液相色谱法等。沉淀法分为有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法，Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins.IV.A System for the Separation into Fractions of the Protein andLipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids.(J.Am.Chem.Soc.1964：459-475)介绍的有机溶剂沉淀法易引起蛋白质变性，沈同、王镜岩主编的《生物化学》(第二版)上册，(高等教育出版社，北京，1994，p.210-222.)介绍的等电点沉淀法只能用于去除等电点相距较大的杂蛋白，上书介绍的电泳法、层析法和中国专利ZL 94190708提供的液相色谱法虽制品纯度高，但处理量小、费时、费力，主要用于蛋白质的定量分析、检测和精制。

提取血红蛋白用萃取法，主要有双水相萃取和反胶团萃取，其中用两种亲水性聚合物或聚合物盐混合后形成的双水相萃取体系研究，已成为实验室或工业规模分离蛋白质等生物材料的适用技术，但Purification of Recombinant Protein A by Aqueous Two-phaseExtraction Intergrated with Affinity Precipitation.Biotechnol.Bioeng.(1992，40：1381-1387)提供的聚合物/盐双水相萃取体系，该体系相分离操作要用分液漏斗，操作繁琐；而在聚合物/聚合物双水相萃取体系中，由于两相密度相近，相系粘度很大，导致相分离困难，且由于高聚物的性质，生物大分子在两相界面存在较强的吸附及乳化作用，导致蛋白质的两相滞留。《(生物工程学报》，1997，13(4)：430-432.介绍的反胶团萃取技术在1998年孙彦编著的《(生物分离工程》，北京化学工业出版社出版的一书谈到此法必须添加的表面活性剂与蛋白质在静电引力作用下极易形成复合物，沉淀于相界面，引起蛋白质的变性。

                   发明内容

本发明的目的是克服了双水相技术萃取血红蛋白相分离困难和反胶团技术萃取血红蛋白引起蛋白质的变性的缺陷，提供一种液-固亲和萃取体系分离纯化血红蛋白的方法，所需设备简单，分离纯化成本低，速度快，成相容易，成相后直接倾出液相即可使液固两相分离，无须双水相萃取中的离心等操作，不用有机溶剂，无毒性，成相聚合物及盐对蛋白质有稳定和保护作用，萃取分离选择性好，萃取容量大，是易于规模放大分离纯化血红蛋白的新技术。

本发明是这样实现的：在具塞比色管中，加入浓度为0.5-3.0mol·L^-1无机盐，无机盐的浓度与聚合物的种类、浓度有相关性，pH控制在3.0～9.0，加入浓度为3～20％成相聚合物溶液(聚合物浓度根据盐的种类、浓度不同而有差异)和浓度为0.2～2.0g·mL^-1聚乙二醇(PEG)修饰物溶液，然后加入血样，用二次水定容，置于康氏电动震荡机上平置振荡2-10分钟，优选4-6分钟，取下倒置10-20分钟，优选12-16分钟，体系分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被萃入固相；

上述固相加二次水溶解后，加入浓度为0.5×10^-3-2.0×10^-3mol·L^-1乙二胺四乙酸和浓度为0.5-3.0mol·L^-1无机盐，置于康氏电动震荡机上平置振荡2-10分钟，优选4-6分钟，取下倒置10-20分钟，优选12-16分钟，体系重新分成聚合物固相和盐水液相，血红蛋白被反萃入液相；

上述萃入液相的血红蛋白于透析袋中进行透析，小分子的盐、少量聚合物可以通过透析袋，而留在透析袋中血红蛋白大分子，其纯度可达到99％以上。