[发明专利]基于绿色荧光蛋白检测细胞凋亡的方法

权利要求书

1.一种用于检测在细胞凋亡中半胱天冬酶或蛋白酶激活的荧光蛋白构建体，含有：

a.一个供体荧光蛋白；

b.一个受体荧光蛋白；以及

c.一个含有半胱天冬酶或蛋白酶的底物序列的连接供体荧光蛋白和受体荧光蛋白的肽连接头。

2.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中至少一个供体荧光蛋白或受体荧光蛋白含有Aequorea-相关的荧光蛋白。

3.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中供体荧光蛋白和受体荧光蛋白均是Aequorea-相关的荧光蛋白。

4.如权利要求3所述的荧光蛋白构建体，其中供体荧光蛋白和受体荧光蛋白均是绿色荧光蛋白。

5.如权利要求4所述的荧光蛋白构建体，其中供体荧光蛋白和受体荧光蛋白选自含有BFP-GFP；CFP-GFP；BFP-YFP和YFP-CFP的供体和受体荧光蛋白对。

6.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中至少一个供体荧光蛋白或受体荧光蛋白含有分离自生物有机体的荧光蛋白。

7.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中的肽连接头含有一个选自半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-12的半胱天冬酶的裂解位点的裂解识别位点。

8.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中的肽连接头实质上含有具有4至30个氨基酸的多肽。

9.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中的肽连接头侧接于甘氨酸氨基酸。

10.如权利要求1所述的荧光蛋白构建体，其中连接供体荧光蛋白和受体荧光蛋白的肽连接头含有两个或更多的半胱天冬酶或蛋白酶的底物序列。

11.编码如权利要求1-10中任一项所述蛋白构建体的核酸。

12.含有如权利要求11所述核酸的表达构建体。

13.含有如权利要求1-10中任一项所述蛋白构建体的分离的宿主细胞。

14.含有如权利要求11所述核酸的分离的宿主细胞。

15.含有如权利要求12所述表达构建体的分离的宿主细胞。

16.含有如权利要求11所述核酸的基因传递载体。

17.一种用于检测在细胞凋亡中半胱天冬酶激活的方法，包括在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养含有如权利要求1所述的蛋白构建体或编码如权利要求1所述的蛋白构建体的核酸的宿主细胞并检测样本中的荧光特性，其中半胱天冬酶激活的细胞凋亡或细胞程序性死亡在样本细胞中的存在导致供体蛋白和受体蛋白之间的荧光共振能量转移的程度的变化。

18.如权利要求17所述的方法，进一步包括对荧光能量转移程度变化的定量测定。

19.一种检测在细胞凋亡中某种试剂是否改变了宿主中半胱天冬酶或蛋白酶激活的方法，包括用试剂接触含有如权利要求1所述的蛋白构建体或编码蛋白构建体的核酸的宿主细胞，并在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养该细胞，及检测样本荧光特性，其中试剂的活性通过在试剂的存在或不存在时的荧光特性的变化而检测。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述试剂选自小分子化合物，蛋白，核酸，核酶，反义核酸以及来自传统中药的分离的化合物及其化学衍生物。

21.如权利要求19所述的方法，进一步包括提供宿主细胞的第二样本并在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养第二样本，并比较两个样本中荧光共振能量转移的程度。