[发明专利]基于绿色荧光蛋白检测细胞凋亡的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测细胞凋亡或检测细胞程序性死亡的组合物和方法。

发明背景

在本发明公开的内容中，不同的文献通过第一作者和日期，在括号内的，专利号或文献号被引用。完整的文献引用被提供在本申请的末尾用于参考。这些文献的内容通过引用被合并到本申请中用来更全面的描述本申请的相关技术。

细胞凋亡，也称为细胞程序死亡(“PCD”)，是在维持生物体的正常生理功能中起重要作用的非常重要的细胞过程[1，2]。例如，当DNA在细胞中被损伤且不能被修复时，细胞将进入细胞凋亡来避免在组织中形成畸形变态。此外，细胞凋亡过程被用于胸腺中来去除自我反应的T细胞从而来避免自身免疫。细胞凋亡必需被精确地调控来维持我们机体的正常功能。例如激活细胞凋亡的失败可引起癌症或自身免疫病[3]。另一方面，细胞凋亡的激活过度可导致有机体的巨大的损伤；其可导致很多的神经变性疾病例如亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease)和阿耳茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)[4，5]。

由于很多重要的疾病，包括癌症，AIDS，自身免疫疾病以及神经变性疾病与细胞凋亡的不足或过度有关，能够启动或阻止细胞凋亡的药物在治疗很多的疾病中均是非常有用的。因此，在分子基础上研究细胞凋亡的过程是非常有意义的。指示细胞凋亡过程的信号途径是非常复杂的[6-8]。很多外部信号可以引发细胞凋亡的开始，包括UV照射，“死亡区域”通过TNF(肿瘤坏死因子)受体的激活，激素(例如，肾上腺皮质激素)治疗或化学疗法药物(例如，喜树碱)[6-9]。同样作为内部信号，已知细胞凋亡是细胞内事件程序性级联的结果，其主要激活一类称为半胱天冬酶(caspases)的半胱氨酸蛋白酶[7，10]。半胱天冬酶是死亡蛋白酶且彼此之间是异体同型的。它们在进化中是高度保守的且被发现可存在于从人到昆虫，线虫和水螅中[23-25]。在人体超过一打的半胱天冬酶已被鉴定，其中的三分之二被确信在细胞凋亡中行使功能[25，26]。

所有已知的半胱天冬酶具有一个活性位点半胱氨酸且在Asp-Xxx键处裂解底物。每一种半胱天冬酶的显著的特性通过裂解位点的4个残基氨基末端被检测[27]。半胱天冬酶被依据底物特异性，序列同源性以及结构相似性的程度被分成亚族。综述细胞凋亡的生物化学和半胱天冬酶的作用参见Hengartner，M.(2000)自然(Nature)407：770-776。

目前，存在很多技术可以检测细胞凋亡在不同阶段的作用。例如，细胞凋亡的终止阶段可通过细胞的形态学变化被测定(例如存在凋亡体(apoptotic bodies))。在此之前，细胞凋亡可通过利用凝胶分析或TUNEL技术的DNA断裂来被检测[11]。细胞凋亡的早期阶段可通过Annexin V-FITC标记的蛋白[12]检测PS(磷脂酰丝氨酸)在膜中的转移来测定，或通过检测半胱天冬酶-3利用荧光染料连接到底物肽上的激活来测定[13]。然而所有的这些技术具有特定的局限性，例如凝胶分析仅被用于细胞的提取物，而不能用于单个细胞或完整的细胞。TUNEL方法仅仅可被应用于固定化细胞，而不是活的细胞。Annexin V仅仅检测外细胞表面而不是细胞内的情况。利用连接荧光染料肽的半胱天冬酶探针也具有其自己的局限性。首先，此探针不能穿透细胞膜，典型的其用于测定细胞提取物。其不能够进行体内测定。其次，半胱天冬酶裂解产生的荧光变化主要包括染料发射谱的迁移而不是荧光的全部破坏。其敏感性是有限的。因此，需要一种有效和精确的组合物和方法来检测程序性细胞死亡。本发明满足了这种需求并同时提供了相关的优点。

本发明也提供了实现可更好理解细胞凋亡的调控机制的研究以及有助于发现和改进新药来克服很多重要疾病的工具。

发明内容

目前，人们强烈地需要改进有效的方法来检测活细胞中的细胞凋亡过程的激活。本发明的检测方法基于的事实是程序性细胞死亡涉及一系列胞内称为“半胱天冬酶”的细胞内蛋白酶，这些半胱天冬酶的底物通常共享称为“底物序列”的共有序列识别和裂解氨基酸序列。通过遗传工程技术，分子探针被制备来通过插入编码底物序列的基因到连接两种不同颜色的荧光蛋白分子且显示荧光共振能量转移(FRET)特性的连接头上测定半胱天冬酶活性。当此改造的基因在细胞中表达时，其基因产物(例如探针的蛋白)是特异性半胱天冬酶的底物且在激活的基础上被半胱天冬酶裂解。在细胞裂解之后，探针的FRET特性被破坏。因此，半胱天冬酶的激活通过调控荧光探针的荧光特性的变化被检测。