[发明专利]一种基因工程新药－安琪抗栓因子的高效生产方法

权利要求书

1、一种基因工程新药安琪抗栓因子的高效制备方法，其特征在于人工设计编码基因DNA序列，并采用全基因分段合成、PCR拼接获得所说因子基因序列，通过将其串联为多聚体与表达载体连接，构建为重组表达质粒，转化原核或真核细胞，表达安琪因子蛋白质并进行提取、分离与纯化。

2、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于人工设计编码基因是选用大肠杆菌的喜好密码子替代安琪因子基因DNA序列中的非喜好密码子，并考虑密码子间的合理组合，设计全新的安琪因子基因DNA序列如下：  1 atggaatgcg aatccggtcc gtgctgccgt aactgcaaat tcctgaaaga aggtactatc 61 tgcaaacgtg ctcgtggtga cgacatggac gactactgca acggtaaaac ttgcgactgc121 ccgcgtaacc cgcacaaagg tccggctact

3、如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是采用全基因分段合成、PCR拼接，分步延长合成安琪因子基因片段L₁、L₂和R₁：L₁：  1  gggaattcat ggaatgcgaa tccggtccgt gctgccgtaa ctgcaaattc ctgaaagaag 61  gtactatctL₂：  1  cctgaaagaa ggtactatct gcaaacgtgc tcgtggtgac gacatggacg actactgcaa 61  cggtaaaaR₁：  1  agtagccgga cctttgtgcg ggttacgcgg gcagtcgcaa gttttaccgt tgcagtagtc 61  g

4、如权利要求1、2或3所述的制备方法，其特征是先以L₂、R₁两链末端部分互为模板进行PCR反应，获得L₂-R₁ PCR产物；再以L₁与L₂-R₁互为模板进行PCR反应，获得安琪因子基因全序列。

5、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于一种基因串联表达模式，是在DNA水平上，将安琪因子的DNA序列串联为多聚体，并用原核或真核细胞表达安琪因子基因串联重复多聚体。

6、如权利要求5所述的制备方法，其特征是根据安琪因子的DNA序列，设计安琪因子多肽单体及间隔片段的核苷酸序列：其中，划线的核苷酸序列为插入间隔片段序列；方框部分序列为同尾酶如Pst1和Nst1的识别位点，在同尾酶识别位点前后加上合适的酶切位点如EcoR1和BamH1用于安琪因子基因多聚体的拼接。

7、如权利要求1或5所述的制备方法，其特征是利用同尾酶具有识别水解不同核苷酸序列但产生相同粘性末端、且当二者的粘性末端相连后该片段不能再被同尾酶识别切割的特点，通过将安琪因子的基因序列重复串联为多聚体，优选在原核细胞中进行表达，获得表达效率高、生产成本低的目标肽段成分。

8、如权利要求1、5、6或7所述的制备方法，其特征是将编码该因子的49个氨基酸中的第28位氨基酸(蛋氨酸)用亮氨酸取代，形成安琪因子突变体，并将蛋氨酸插入安琪因子基因单体分子间作为溴化氰裂解位点，以便在表达后纯化时将目的肽段的多聚体断裂加工为目标肽段单体。

9、如权利要求1、5、6、7或8所述的制备方法，其特征是将该因子基因序列单体或串联的多聚体分别与表达载体连接，构建为重组表达质粒，转化原核细胞或真核细胞，表达安琪抗栓因子蛋白质。

10、如权利要求1、5、6、7、8或9所述的制备方法，其特征是将表达的安抗琪栓因子蛋白质从细胞中，经溶菌、裂解、提取、纯化，并经溴化氰降解，最后得到色谱纯化的安琪因子蛋白质。