[发明专利]一种基因工程新药－安琪抗栓因子的高效生产方法

说明书

技术领域：本发明涉及用基因工程技术高效生产新型抗栓药物安琪(Anqi)因子的方法。

背景技术：

血栓形成、肿瘤转移及骨质破坏吸收长期以来严重影响着人类的健康，因其发病机制尚未被完全认识，一直缺乏有效的治疗方法。近年来，随着关于细胞间相互作用的学说——细胞粘附理论的不断完善，细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的粘附、转运被认为是以上疾病发生的中心环节。进一步研究发现，一种三肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)和其相应配体的结合是细胞相互作用的必需环节，阻断此环节的研究将对以上疾病的发病机制和治疗有着重要的理论和现实意义。安琪因子是一种存在于蝰蛇蛇毒中的天然蛋白分子(Echistatin)，共有49个氨基酸，分子量5400Da，其24-25-26位氨基酸为Arg-Gly-Asp(精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸)三肽序列，即RGD序列。安琪因子中的RGD序列及其它活性结构(尤其是其特有的C-末端)使它具有多种生物学功能。安琪因子可选择性地抑制活化血小板和纤维蛋白原的结合，并抑制血小板聚集正调节通路中蛋白因子的活化而具有抗血栓的作用；安琪因子可抑制破骨细胞的功能，抑制骨质吸收过程；安琪因子也可促进肿瘤细胞发生凋亡，抑制由TGF因子介导的肿瘤细胞转移等抗肿瘤功能。

安琪因子分子量小、RGD序列及其与周围序列所形成的空间结构使该物质在作用效果、免疫原性、副作用、基因工程制备方面具有明显的优势，成为目前全球抗栓、抗肿瘤药物研究的热点。经国内外专家科学实验证明，安琦因子显示出抗栓、抑制肿瘤转移、抗骨质疏松等药理作用，具有重大的临床应用价值。

由于蛇毒来源少、提取困难且价格昂贵，难以用传统提取工艺大量制备安琪因子，采用基因工程技术制备安琪因子是一种经济实用的方法。有学者已制备了重组Echistatin并证实其具有与野生蛋白同等的功效。但目前所使用的制备方法均以科学实验为目的，产率低且活性不稳定，不适于其进一步开发和大量制备。

发明目的：

本发明的目的是运用基因工程技术制备抗栓药物——安琪因子，主要是通过对目的基因的全新设计以及对传统制备工艺的合理改进，以实现安琪因子的高效表达。发明内容：

本发明运用基因工程、蛋白质工程及现代分子生物学技术构建了人工全合成的安琪因子基因，利用原核表达载体pBV220在大肠杆菌DH5α中以包涵体形式获得高效表达。运用该表达体系可大幅度降低安琪因子的生产成本，从而创立了一套独特高效的大规模制备重组安琪因子的生产工艺，这将带来抗栓药物及相关产业的更新换代，具有极大的社会经济效益和商业前景。

下面将对本发明进行详细描述。

本发明以运用基因工程技术高效制备安琪因子为目的，通过对目的基因的全新设计以及对传统制备工艺的合理改进，实现安琪因子的高效表达。

采用通常的技术改进手段，如上游表达载体序列的优化、下游工程的改良等，对安琪因子的表达量的提高无明显效果。本发明从异源蛋白在大肠杆菌中表达水平的另一重要影响因素——基因的密码子构成入手，对安琪因子基因进行了全面的设计与合成。

同一种氨基酸乃至蛋白质多肽分子，根据密码子的简并性，可由不同的DNA序列来编码。不同生物种对蛋白质编码基因的密码子的喜好性是不同的。采用大肠杆菌的喜好密码子替代安琪因子基因原有的密码子，并充分考虑密码子间的合理组合，是提高安琪因子表达量的可行手段。

本发明根据各种密码子在大肠杆菌中的使用频率以及密码子的常见组合，保留安琪因子基因的氨基酸序列不变，选用大肠杆菌的喜好密码子取代安琪因子基因DNA序列中的非喜好密码子，设计了全新的安琪因子基因DNA序列(图1)。

根据所设计的DNA序列，采用全基因分段合成和PCR拼接的策略，构建人工合成的安琪因子基因。

用EcoR I和Pst I完全酶切全长的安琪因子基因，插入经EcoR1和Pst I双切的pBV220原核表达载体中，获得重组质粒pBV220-Anqi(图2)，转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆37℃过夜活化后，采用温度诱导的表达方式使其表达。离心收集菌体，加入100μl1X上样缓冲液，100℃煮沸5min，15％SDS-PAGE电泳检测安琪因子表达(图3)，经凝胶扫描分析，安琪因子表达量达到菌体蛋白的26％，比原有菌种的表达水平提高了约30％。

人工全合成的安琪因子的大量表达及纯化：