[发明专利]利用废渣和废水固态发酵生产果胶酶

说明书

果胶酶是一种工业用酶制剂，它的主要性质是降解果胶物质。果胶酶这一性质主要应用于果汁加工和果酒酿造。此外，果胶酶在茶和咖啡的发酵、桔子脱囊衣、麻料脱胶、废水处理、造纸、榨油等领域也有应用。作者最近申请的一项发明专利成功地将其应用于诱导植物抗病。

目前生产果胶酶的培养基主要包括：诱导物、碳源、氮源和微量元素。其中诱导物主要是果胶或富含果胶质的生物质，碳源以糖类和麦麸为主，氮源主要有蛋白胨、酵母膏、玉米汁及无机铵盐。本发明以果胶酶高产菌株黑曲霉CGMCC0455为生产菌，以废渣和废水为原料进行固态发酵生产果胶酶。该方法主要特点如下：1.含果胶质的废渣作为诱导物和碳源；2.以味精废水作为氮源和水分，3.味精废水中还含有大量的有机质和一些微量元素，可以促进黑曲霉的生长。4.接种黑曲霉CGMCC0455，于温度30～32℃、环境湿度75％、接触空气条件下，静置培养4天达到产酶高峰。5.经水浸提，即得果胶酶溶液。6.脱胶法测定酶活力，果胶酶产率达到1.5×10⁴单位/克甜菜渣。该方法制备果胶酶所用原料价廉，酶产率高，发酵周期短，工艺简单，具有很高的工业化开发价值；并且为高浓度有机废水的处理提供了一条新途径。

本发明所述的果胶酶制备方法内容如下：1.本发明所用黑曲霉CGMCC0455菌株是从环境中分离、筛选获得。该菌株保存于甜菜渣  废水培养基，其培养基组成如下：甜菜渣20.0克，味精废水1.0升，琼脂15.0克。2.产酶培养基组成比例(w/w)如下：甜菜渣45％，味精废水(浓缩至氨氮含量4.0％，pH  调节到中性)54％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.8％，KH₂PO₄ 0.2％。3.固态发酵操作方法如下：按2所述的原料比配制备培养基；培养基分装于500mL的三角  瓶中，每瓶30g，于0.1Mpa压力下蒸气灭菌20分钟，也可直接用生发酵；接种1所  述方法制备的菌种，于温度30～32℃、环境湿度75％、接触空气条件下，静置培养4天，  用水浸提，即得果胶酶溶液。4.果胶酶测定采用脱胶法，测定方法如下：取5mL当天配制的1％果胶溶液(用pH4.2的  0.05M柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液和柑橘果胶配制)置于25×250mm的试管中，加入  pH4.2的0.05M柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲溶液10mL，试管于40℃恒温水浴预热平衡5分  钟，加入5mL稀释一定倍数的酶液，并立即开始计时，反应3分钟后取样1mL放入试  管，立即加入2滴1％I2/KI溶液，摇匀，再加入2mL异丙醇，转动试管，观察沉淀是否  消失，准确记录脱胶时间。酶活力单位定义：在上述操作条件下，30分钟使1毫克果胶  完全脱胶所需的酶量为一个酶活力单位。

实施例1：不同氮源对产果胶酶的影响

菌种黑曲霉CGMCC0455保存于4℃冰箱内甜菜渣废水培养基斜面，半年转接1次。

固态发酵产酶实验：分别以废水、各种无机氮源和有机氮源与菜渣制备产酶培养基，各培养基的配比都是甜菜渣45％(w/w)，氮2％(w/w)，水分53％(w/w)左右，少量磷酸盐。接种黑曲霉CGMCC0455进行固态发酵，结果见表1。

                         表1

      氮源                      酶产率(单位/克菜渣)

    (NH₄)₂SO₄                    1.50×10⁴

    NH₄Cl                          5.98×10³

    NH₄NO₃                        2.90×10³

    NaNO₃                          3.41×10³

    柠檬酸三钠                      8.42×10³

    尿素                            9.46×10³

    谷氨酸单钠                      9.49×10³