[发明专利]通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法

说明书

发明背景

大部分生物医学科学本身基于使用通过提取技术获得的天然来源的药物活性蛋白和通过来自重组DNA的技术获得的合成来源的药物活性蛋白。有意义产物的纯度水平在这两种情况中均是重要的，因为可以通过在有固定量蛋白质存在的情况下严格结合生物作用的可能性来确定对其活性的了解。

在上下文中，药物活性蛋白的纯化方法占重要部分，因为当涉及药物制品中包含的活性成分或赋形剂时，所制备的蛋白质的纯度具有重要意义。在治疗过程中导致毒性作用和/或产生不良作用的可能性实际上促使负责基于蛋白质的药品的销售的注册与授权的管理机构引入从未有过的更为严格的法规以便确保在销售药品中包含的蛋白质来源的活性成分的质量和生产一致性。

从上述描述中显然可以看出蛋白质纯化方法的重要性，其中存在的主要困难在于药物活性蛋白始终与许多其它蛋白质一起存在于复合的混合物中。

这一事实在天然来源用于从动物或植物器官中提取类似于血液这样的药物活性蛋白和使用重组DNA技术这两种情况中均是存在的，因为所述的蛋白质表现出与它们来源无关的两者之间相似的化学-物理特性。

因此，从上述描述中可以得出：就纯化药物活性蛋白而言，必须从混有具相似特性且通常大量超过所需蛋白量的其它蛋白质中分离出具有高纯度的蛋白质。

工作方向是明确的且通常使用几个纯化步骤以便获得所需的纯度水平。在这种方式中纯化方法变得极为复杂且成功进行蛋白质的工业化生产主要要与纯化方法的效率结合，因为后者充分决定着生产成本。

许多技术用于纯化蛋白质，例如：在含水和有机溶剂中或使用caotropic agents的选择性沉淀；通过过滤和/或透析的分离；使用适宜抗体的免疫沉淀法；层析法。在这些方法中，后者在近年来已经取得了更大的进展，主要是因为这些方法可以获得所需的纯度，正如Regnier F.E.在J.Chromatogr.418，115-143(1987)中所报导的。

科学文献中引用了许多技术且可以基于用于分离蛋白质的作用机理对其进行分类，例如：基于分子量的分离；在极性基质、也称作常态固定相上的吸附；在非极性基质、也称作反固定相上的吸附；通过使用与惰性基质，诸如铜、锌、铁和铂这样的重金属，类似于亮蓝这样的化学染料，类似于蛋白质A和蛋白质G这样的蛋白质，类似于多糖和葡糖胺聚糖这样的碳水化合物结合的配体进行的选择性亲和吸附；使用结合在惰性基质上的特异性抗体进行的免疫亲和吸附；使用结合在惰性基质上的带静电荷的配体进行的离子相互作用的吸附。

将选择性、即选择性识别所需蛋白质的能力、成本和在工业化水平上使用的可能性用作评价不同层析技术性能的参数。

基于这些参数，将免疫亲和层析看作可确保有更大的选择性，不过，它表现出类似于使用成本高、存在使抗体变性的风险和与纯化产物最终安全性相关的风险这样的缺点，这是因为所述的抗体来源于动物。

将使用离子相互作用、也称作离子交换层析的层析法看作用于保持蛋白质药物活性且易于以使用低成本控制的工业化方式进行的几乎没有风险性的技术，不过，这项技术表现出选择性较差的缺点。

因此，极为有利的是找到实施离子交换层析的条件，这些条件可增加其选择性以便从获得产物的纯度的观点来看使它与其它技术相差无几。

通常使用各种大小的柱进行离子交换层析，这些柱上填充了含有持久或在特定条件下带静电荷的化学基团的固体基质。

上离子交换柱的化合物通过库仑引力/斥力与结合基质的电荷发生相互作用。混合物中含有的不同化合物自身能够与起所带电荷量的作用的固定相结合且结果是它们或多或少被保留，从而确保它们在柱口分离。

当基质的电荷是负性时，所述的层析法称作阳离子交换层析，因为阳离子被吸附，而当基质的电荷是正性时，所述的层析法称作阴离子交换层析。

蛋白质是具有高于10,000道尔顿的高分子量的由氨基酸的非均相聚合物构成的化合物；某些氨基酸在其侧链上带有可以在带负电的酸性氨基酸或带正电的碱性氨基酸溶液的pH作用下离子化的官能基且由此所有的蛋白质均带有大量的负电荷和正电荷。蛋白质的等电点pI是蛋白质呈中性时的pH，因为提供的负电荷等于提供的正电荷；进入pI下的电场的蛋白质不被电场中任意的极性端所吸引。

负电荷的数量在高于pI的pH下增加且蛋白质获得了净负电荷，而相反的情况在低于pI的pH下发生且蛋白质获得了净正电荷。每种蛋白质均具有其自身的特征pI，它可使该蛋白质与其它蛋白质区别开来且某些蛋白质在等电点下倾向于变得不溶。