[发明专利]用于亲和纯化的工程蛋白酶及融合蛋白的加工

权利要求书

1.编码融合蛋白的核酸构建物，其中该构建物包括目的蛋白的编 码序列和枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白的编码序列，其中的融合 蛋白包括与枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白的C-末端可操作连接的 目的蛋白，其中的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白与枯草芽孢杆菌 蛋白酶或其变体以10nM或更低的Kd结合形成稳定的复合物，并且其 中的枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体有效切割来自枯草芽孢杆菌蛋白酶 前结构域蛋白的目的蛋白，以及其中的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域 蛋白在切割目的蛋白后保持与枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的结合， 其中所述的枯草芽孢杆菌蛋白酶变体选自S149，S160，S188，S189， S190，S191，S193，S194，S196，S197，S198，S199，S201和S202， 其中枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白通过用氨基酸序列FKAM、 FKAY或FKAF替换P4至P1的氨基酸而进行修饰，或者枯草芽孢杆 菌蛋白酶前结构域蛋白包括用作同源序列的氨基酸残基 EEDKL(F/Y)QS(M/L/Y)。

2.融合蛋白，包括可操作连接到枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋 白的C-末端的靶蛋白，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白被修饰 以10nM或更低的Kd结合枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体形成稳定的复 合物，并且其中的枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体有效切割来自枯草芽 孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白的靶蛋白，以及其中的枯草芽孢杆菌蛋白 酶前结构域蛋白在切割来自修饰的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域后保 持与枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的结合，其中所述的枯草芽孢杆菌 蛋白酶变体选自S149，S160，S188，S189，S190，S191，S193，S194， S196，S197，S198，S199，S201和S202，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶前 结构域蛋白通过用氨基酸序列FKAM、FKAY或FKAF替换P4至P1 的氨基酸而进行修饰，或者枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白包括用 作同源序列的氨基酸残基EEDKL(F/Y)QS(M/L/Y)。

3.权利要求2的融合蛋白，其中靶蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白A_B结构域；蛋白A_B突变体A219；链球菌蛋白G_B结构域；链球菌蛋白 G_a结构域；蛋白G_B突变体G311；大肠杆菌假定的Yab；牛转导素的 α亚单位；甲烷杆菌(M.thermautotrophicus)CDC6；链霉亲和素；亲 和素；Taq聚合酶；碱性磷酸酶；RNase；DNase；限制性内切酶；过 氧化物酶；内-1，4-β葡聚糖酶；内-1，3-β-葡聚糖酶；几丁质酶；β和 α葡萄糖苷酶；β和α葡苷酸酶；淀粉酶；葡萄糖基转移酶；磷酸转 移酶；氯霉素-乙酰转移酶；β-内酰胺酶；荧光素酶；酯酶；脂肪酶； 蛋白酶；细菌素；抗生素；酶抑制剂；生长因子；激素；受体；膜蛋 白；核蛋白；转录因子；翻译因子或核酸修饰酶。

4.一种生产结合枯草芽孢杆菌蛋白酶的融合蛋白的方法，该方法 包括：

提供编码融合蛋白的核酸构建物，其中该融合蛋白包括与枯草芽 孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白的C-末端可操作连接的目的蛋白，其中枯 草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白被修饰以10nM或更低的Kd结合枯草 芽孢杆菌蛋白酶或其变体形成稳定的复合物，其中的枯草芽孢杆菌蛋 白酶或其变体有效切割来自枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白的目的 蛋白，以及其中的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白在切割来自修饰 的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域后保持与枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变 体的结合，其中所述的枯草芽孢杆菌蛋白酶变体选自S149，S160，S188， S189，S190，S191，S193，S194，S196，S197，S198，S199，S201和 S202，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白通过用氨基酸序列 FKAM、FKAY或FKAF替换P4至P1的氨基酸而进行修饰，或者枯草 芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白包括用作同源序列的氨基酸残基 EEDKL(F/Y)QS(M/L/Y)；

用核酸构建物转染宿主细胞；以及

在适合表达融合蛋白的条件下培养转化的宿主细胞。