[发明专利]用于亲和纯化的工程蛋白酶及融合蛋白的加工

说明书

发明背景 

发明领域

本发明涉及纯化方法，和更具体地涉及包含靶蛋白和蛋白酶前结构域蛋白的融合蛋白，其中前结构域蛋白与相应的蛋白酶或其变体具有高度亲和力从而以提供随后用于回收靶蛋白的蛋白酶结合复合物。 

背景技术

重组DNA技术已经促进了用于医药和生物技术多种应用的蛋白的表达。然而，重组蛋白的纯化通常是复杂和难以解决的。大规模，经济的纯化蛋白通常包括由细胞培养物，比如通过插入含有所述蛋白基因的重组质粒基因工程化产生目的蛋白的细菌细胞系而产生蛋白。从供应给细胞的化合物的混合物及从细胞自身的副产物中分离需要的蛋白到足以用作人药物的纯度构成艰巨的挑战。 

用于从细胞碎片纯化蛋白的方法最初取决于蛋白表达的位置。一些蛋白可以直接从细胞分泌到周围生长介质；其它的蛋白则在细胞内制备。对于后一种蛋白，纯化过程的第一步包括裂解细胞，可以通过各种方法完成，包括机械剪切，渗透压冲击或酶处理。这样的破裂将细胞的全部内容物释放进入组织匀浆，此外产生由于其较小而难以除去的亚细胞碎片。这些通常通过差速离心或过滤除去。由于在蛋白生产过程中细胞的自然死亡和细胞内宿主细胞蛋白的释放而出现与直接分泌的蛋白相关的相同问题，尽管程度上较小。 

一旦获得含有目的蛋白的澄清溶液，通常尝试使用不同的技术组合将其与细胞产生的其它蛋白分离开来。作为蛋白的总体回收方法的一部分，蛋白可以暴露于结合到蛋白的固定化试剂。 

后基因组时代蛋白质组的启动大大地增加了对于快速，有效和标准的蛋白纯化和分析方法的需求。例如，重组蛋白经常与其它的蛋白或肽融合以促进纯化。融合的结构域用作亲和纯化的临时钩子(hook)并最终必须通过位点特异性蛋白水解而被切割掉。许多使用不同的载体蛋白的融合蛋白系统目前市场上可以买到，特别是用于大肠杆菌(E.coli)的表达。例子包括麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽S转移酶，生物素羧基载体蛋白，硫氧还蛋白和纤维素结合结构域。 

融合蛋白表达使用固定化的，特异于载体蛋白的中等亲和力的配体通过亲和层析简化从细胞提取物分离重组蛋白。然而固定化通常要求配体共价附于基质，在很多情况下导致活性的损失。广泛使用的产品的典型例子是蛋白A Sepharose。这个非常昂贵的产品用来通过亲和层析纯化IgG，以及用于许多诊断方案。 

因而，目前非常需要更经济且技术上简单的不包括大规模亲和步骤的纯化可溶蛋白的方法。 

蛋白酶功能的范围从广泛特异性的降解性酶到调节胚胎发育到细胞死亡的生理过程的高度序列特异性的酶。一些高度特异性蛋白酶已经从自然中获得作为蛋白纯化和分析的工具，在某种意义上的方式类似于使用限制性核酸内切酶以操作DNA。现有具体的加工酶来自于哺乳动物来源，比如凝血酶，因子Xa和肠激酶。然而，尽管广泛地用于蛋白工作，这些天然酶非常昂贵而且低稳定性限制了其用于许多应用的用途。 

相当多的努力已经被致力于工程化改造耐用的，细菌性蛋白酶比如枯草芽孢杆菌蛋白酶以切割所限定的序列。枯草芽孢杆菌蛋白酶是革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶。枯草芽孢杆菌蛋白酶是重要的工业酶还是了解受酶影响的大量速率增加的模型。许多枯草芽 孢杆菌蛋白酶的氨基酸顺序是已知的，包括来自杆菌菌株的枯草芽孢杆菌蛋白酶，例如枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN′，枯草芽孢杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草芽孢杆菌蛋白酶DY，枯草芽孢杆菌蛋白酶amylosacchariticus，和mesenticopeptidase。出于这些以及及时克隆基因，方便表达和获得纯化和原子分辨率的结构的原因，枯草芽孢杆菌蛋白酶成为1980年代蛋白工程研究的模型系统。十五年后，已经在科学文献中已经报道了远远超过枯草芽孢杆菌蛋白酶275个氨基酸的50％的突变。大多数的枯草芽孢杆菌蛋白酶工程改造涉及催化的氨基酸，底物结合区域和稳定性突变。诱变得最显著的枯草芽孢杆菌蛋白酶[1，2]是来自杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(BPN′)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(枯草芽孢杆菌蛋白酶E)和缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)(Savinase)分泌的枯草芽孢杆菌蛋白酶。 

尽管枯草芽孢杆菌蛋白酶的蛋白工程中的强活性，先前还不能将该蛋白从具有广泛底物偏爱的蛋白酶转化为适于处理特异性底物的酶从而使其可用于蛋白回收。因而，能使用低特异性蛋白酶比如枯草芽孢杆菌蛋白酶用于纯化过程对于研究和蛋白纯化是非常有用的。 

发明概述