[发明专利]生产分泌性三聚受体类似物和生物活性融合蛋白的方法与组合物

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质表达的方法，更具体来说涉及产生和表达例如三聚可溶性受体的分泌性和生物活性的三聚蛋白的方法。

背景技术

在例如人的多细胞生物体中，细胞通过所谓的信号转导途径彼此通讯，其中分泌性配体(例如细胞因子、生长因子或激素)结合其细胞表面受体，导致受体激活。受体是膜蛋白，其由负责配体结合的胞外域、中心跨膜区和负责向下游发送信号的胞质域组成。取决于分泌信号的来源和表达受体的靶细胞的位置，信号转导可以以下三种方式发生：旁分泌(邻近细胞间通讯)、自分泌(细胞自身通讯)和内分泌(远端细胞之间通过循环进行通讯)。受体激活(其在细胞膜下面引起包括基因表达激活在内的事件级联)的一种一般机制是，多肽配体(例如细胞因子)以寡聚形式存在，例如同型二聚体(homo-dimmer)或三聚体，其当在细胞外表面结合至其单体受体时导致受体的寡聚化。信号转导途径在正常细胞发育和分化以及响应例如细菌和病毒感染的外部损害中起重要作用。在此信号转导途径中，激活不足(例如缺乏配体)或过度激活(例如配体过多)形式的异常是例如关节炎、癌症、AIDS和糖尿病的病理病状和疾病的根本原因。

治疗这些虚弱疾病的当前策略之一涉及使用诱杀受体如仅由胞外配体结合结构域组成的可溶性受体来拦截配体，从而克服受体的过度激活。此策略的最佳实例是由Immunex(其现在是Amgen一部分)产生的Enbrel——一种二聚可溶性TNF-α受体免疫球蛋白(IgG)融合蛋白(Mohler等人，1993；Jacobs等人，1997)。细胞因子的TNF家族是身体为响应感染或组织损伤而产生的一种主要促炎信号。然而，已经证明这些细胞因子的异常产生(例如在不存在感染或组织损伤下)是诸如关节炎和牛皮癣的疾病的根本原因。TNF-α受体在结合至其配体TNF-α之前在细胞表面上天然以单体形式存在，相反，TNF-α以同型三聚体(homotrimer)的形式存在(Locksley等人，2001)。因此，将可溶性TNF-α受体与能够通过二硫键自发二聚化(Sledziewski等人，1992和1998)的免疫球蛋白G1的Fc区融合，使得可以分泌二聚可溶性TNF-α受体(Mohler等人，1993；Jacobs等人，1997)。与单体可溶性受体相比，二聚TNF-α受体II-Fc融合体对同型三聚配体具有极为增大的亲和力。这为其在治疗类风湿性关节炎(RA)中的临床使用提供了分子基础，所述类风湿性关节炎是其中组成性提高的TNF-α(一种主要促炎细胞因子)起到重要致病作用的自身免疫疾病。尽管己证明Enbrel对TNF-α具有pM范围(ng/mL)内的Ki(Mohler等人，1993)，但是RA患者需要进行每周两次25mg(其可变为用μg/mL水平的可溶性受体的形式表示)皮下注射，以达到临床效果(www.enbrel.com)。每个RA患者高水平反复消费Enbrel已经对药物供应造成极大压力以及高额费用，这仅在本国(注：指美国)就限制数百万潜在患者得到所述药物。

除TNF-α家族的有效促炎细胞因子之外，引起AIDS的HIV病毒也使用同型三聚外被蛋白gp120以进入我们身体内的CD-4阳性T辅助细胞(Kwong等人，1998)。HIV感染期间的一个最早期事件涉及gp120结合其在T辅助细胞的细胞表面独特表达的受体CD-4(Clapham等人，2001)。十多年前已证明单体可溶性CD-4是抗HIV感染的有效药剂(Clapham等人，1989)，然而，当证实其功效仅限于实验室HIV分离物时(Daar等人，1990)，人们的兴奋黯然破灭。事实证明来自AIDS患者的HIV株与实验室分离物不同，其对单体可溶性CD-4具有极低的亲和力，可能是因为gp120上的序列变异(Daar等人，1990)。尽管已经制成二聚可溶性CD-4-Fc融合蛋白，但是由于对gp120的低亲和力，这些诱杀性CD-4HIV受体无论是在实验室还是在临床上对来自AIDS患者的天然HIV均表现出极弱的抗病毒作用(Daar等人，1990)。

显然，极其需要能够产生分泌性同型三聚可溶性受体或生物活性蛋白，其可具有对其天然同型三聚配体(例如TNF家族的细胞因子和HIV外被蛋白)的完美对接(dock)结合位点，因而具有更高的亲和力。理论上这种三聚诱杀受体对其三聚配体具有的亲和力应比其二聚对应物更高。这种合理设计的可溶性三聚受体类似物可显著提高临床效果以及降低各患者的药物注射量或频率。为了在治疗上切实可行，和免疫球蛋白Fc一样，所需的三聚蛋白部分理想地应为在体内含量丰富并能够有效发生自身三聚化的天然分泌蛋白的一部分。