[发明专利]编码冠状病毒样颗粒之表达载体

权利要求书

1.一种用于克隆第I类病毒融合蛋白基因及作为DNA疫苗候选物之表达载体，其特征是该表达载体包括：

i)一个第一转录单元，包括冠状病毒之膜蛋白基因，冠状病毒之外膜蛋白基因，及内部核糖体进入序列，其中该内部核糖体进入序列插入至膜蛋白基因及外膜蛋白基因的接合处；

ii)一个第一真核启动子，可操作地连结至膜蛋白基因，其中该第一启动子位于膜蛋白基因之上游且驱动第一转录单元之表达；

iii)一个第二转录单元，包括冠状病毒之刺突蛋白羧基端区域的基因及用于第I类病毒融合蛋白基因之克隆或框内插入之多重克隆位点，其中该多重克隆位点位于刺突蛋白羧基端区域的基因之起始处且具有限制酶剪切位点；及

iv)一个第二真核启动子，可操作地连结至刺突蛋白羧基端区域的基因，其中该第二启动子位于刺突蛋白羧基端区域的基因之上游且驱动第二转录单元之表达；

其中该第一真核启动子之转录活性比第二真核启动子为强。

2.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该冠状病毒为猪、人类或鸟类冠状病毒。

3.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该冠状病毒为猪TGEV冠状病毒、人类229E冠状病毒或人类SARS病毒。

4.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该外膜蛋白基因为如SEQ ID NO：1所述之序列。

5.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该膜蛋白基因为如SEQID NO：2所述之序列。

6.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该刺突蛋白羧基端区域的基因为如SEQ ID NO：3所述之序列。

7.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是进一步包括在宿主细胞中质粒DNA复制始点。

8.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是进一步包括作为选择性标志之抗抗生素基因。

9.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第一及第二转录单元具有polyA信号。

10.根据权利要求9所述之表达载体，其特征是该polyA信号是BGHpolyA信号。

11.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是有如SEQ ID NO：49所述之序列。

12.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该多重克隆位点包括Sma I、BsaB I、EcoR V及BspE I所构成群组之至少一者的限制酶位点。

13.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第I类病毒融合蛋白基因选自由HIV的gp160、流感病毒的HA及SARS病毒的Spike所构成的群组。

14.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第一真核启动子选自由CMV、SV40、RSV、HIV-1、LTR、杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子、肌肉特异肌间线蛋白、肌酸激酶、β肌动蛋白启动子、EF1α及泛素(ubiquitin)启动子所构成的群组。

15.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第一真核启动子选自由pCMV、杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子及β肌动蛋白启动子所构成的群组。

16.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第二真核启动子选自由CMV、SV40、RSV、HIV-1、LTR、杂合之β肌动蛋白/CMV启动子增强子、肌肉特异肌间线蛋白、肌酸激酶、β肌动蛋白启动子、EF1α及泛素启动子所构成的群组。

17.根据权利要求1所述之表达载体，其特征是该第二真核启动子选自由pCMV、SV40、β肌动蛋白启动子及EF1α所构成的群组。