[发明专利]编码冠状病毒样颗粒之表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及重组DNA技术之领域，更具体地说，涉及DNA疫苗之领域。特别是，本发明涉及一种新颖之编码冠状病毒样颗粒之表达载体，该载体用于克隆第I类病毒融合蛋白基因及作为DNA疫苗候选物。

背景技术

疫苗接种在过去三十年期间在病毒性疾病的控制上扮演着重要的角色。疫苗接种基于简单的免疫原理：曾经暴露于一种感染物质后，动物会发动保护对抗该相同物质感染的免疫性防御。疫苗接种的目标是诱发动物在感染之前发动防御。传统上，这是通过利用活的减毒或死的病毒型式作为免疫原而达到的。在过去这些方式的成功已部份达到，因为与生俱来的抗原及减毒病毒的能力，可引发自然感染，引起全面性之免疫反应。然而，传统疫苗方法总有许多潜在的限制。减毒病毒株可能产生突变而变成更具致命性或无免疫原性；不适当的失活化疫苗可能引起原本欲预防的疾病。

重组DNA技术提供了去除传统疫苗限制的潜能，该技术通过基于利用限定抗原而非完整的感染物质作为抗原，使得疫苗的发展变成可行。其中包括胜肽疫苗，由化学合成具免疫反应性之抗原决定部位所构成；亚单元疫苗，由在重组异源细胞中表达病毒蛋白质而制得；及利用活的病毒载体以展现一个或多个限定抗原。而胜肽疫苗及亚单元疫苗皆具有许多潜在的限制，主要的问题在于确保经由模仿天然环境中的抗原所得的工程化蛋白质之构形，具有困难度。而适当的佐剂及载体蛋白质在为胜肽的情况下，一定会激发免疫反应。此外，这些疫苗会诱发主要的体液反应，因此在诱发有效的免疫性上可能会失败。

已有许多不同的方法开发将新的遗传物信息导入目标细胞中。目前，将DNA导入至目标细胞中最有效率的方法，是使用经改良的病毒，即所谓的重组病毒载体。最常用的病毒载体系统以反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或腺相关病毒为基础。所有的系统均具有其特别的优点及缺点。一些载体系统拥有容量可整合其DNA至宿主细胞基因体中，其它者则无。一些载体系统上的病毒基因可完全地自载体上移除，然而其它的系统则尚不可行。一些载体系统具有非常好的活体内传递特性，然而其它则无。一些载体种类非常易于大量制备，而其它则非常难于制备。

冠状病毒在其外套膜上带有三或四种蛋白质。M蛋白为最丰富的成份；小型的E蛋白为最少但为基本的病毒蛋白。S蛋白在致病机制上的重要性，与其在病毒入侵及散播二者之生物功能一致(Collins，A.R.，et al.，1982，Virology 119：358-371；Williams，R.K.，et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5533-5536)。当表达在病毒体外膜时，S蛋白结合在细胞受体并在病毒入侵时诱发病毒及细胞膜的融合。在感染后，表达在受感染细胞的胞浆膜之S蛋白可诱发细胞-细胞融合。S蛋白亦扮演在对病毒感染的免疫反应之角色，作为抗体中和之目标(Collins，A.R.，et al.，1982，Virology119∶358-371)及作为细胞性免疫之诱发物(Bergmann，C.C.，et al.，1996，J.Gen.Virol.77：315-325；Castro，R.F.，and S.Perlman，1995，J.Virol.69∶8127-8131)。M及E蛋白是病毒组装之最小蛋白单元(Baudoux，P，et al.，1998，J.Virol.72：8636-8643；Bos，E.C.，1996，Virology 218：52-60；de Haan，C.A.M.，et al.，1998，J.Virol.72：6838-6850；Godeke，G.-J.，et al.，2000，J.Virol.74：1566-1571；Vennema，H.，et al.，1996，EMBO J.15：2020-2028)。两者均为贯穿性膜蛋白。M及E蛋白之共同表达足以引发病毒样颗粒(VLP)的形成。当S蛋白质与M及E蛋白共同表达时，S蛋白会以推测可信的构形嵌入VLP，此已从老鼠肝炎病毒(MHV)(Bos，E.C.，1996，Virology218：52-60；de Haan，C.A.M.，et al.，1998，J.Virol.72：6838-6850；Vennema，H.，et al.，1996，EMBO J.15：2020-2028)，可传染的肠胃炎病毒(Baudoux，P.，et al.，1998，J.Virol.72：8636-8643)及猫的传染性腹膜炎病毒(Godeke，G.-J.，et al.，2000，J.Virol.74：1566-1571)得到证实。有一假设为冠状病毒膜基本上由侧边与M蛋白交互反应之浓密基质所组成，某些情况下其需要E蛋白才能发芽，若可以的话，通过与M的羰基端及刺突蛋白穿膜区之特定交互反应，将S及HE醣蛋白嵌入于其中(de Haan，C.A.M.，1999，J.Virol.73：7441-7452；Nguyen，V.-P，and B.G.Hogue.1997，J.Virol.71：9278-9284；Opstelten，D.-J.E.，et al.，1995，J.Cell Biol.131：339-349；Vennema，H.，et al.，1996，EMBO J.15：2020-2028)。此种含刺突蛋白的VLP可感染细胞，其与真实病毒具有相同的感染性(Bos，E.C.，1996，Virology 218：52-60)。然而，尚无有效的DNA载体可发展作为DNA疫苗。