[发明专利]用于治疗细菌感染的表达载体

说明书

本申请是美国序号09/883,343 60/054(2001年6月19日提交)的部分继续申请，后者是美国序号08/924,629(现在美国专利6,403,082)的继续申请；和美国序号10/916,641(2004年8月9日提交)的部分继续申请。

I.发明领域

本发明涉及表达载体，其可以用于将至少一种异源基因转移到革兰氏阴性细菌、优选乳酸细菌(LAB)中并在其中表达。本发明还涉及所转化的宿主、异源基因产物、含有所述宿主的发酵物和/或基因产物或者其组合的抗细菌用途。

II.发明背景

许多细菌产生抗细菌肽或者蛋白质(例如，细菌素)，其通常对其他细菌、通常密切相关的细菌具有活性。细菌和它们的细菌素的示例性列表在表1中显示。

典型的细菌素是大肠杆菌(Escherichia coli)产生的大肠杆菌素。多数大肠杆菌素是相对大的蛋白质化合物，其不从细菌细胞主动地分泌。大肠杆菌产生的微生物素是通过专门的输出途径从细胞分泌的肽或者多肽并且被翻译后修饰(I类微生物素)或者不是翻译后修饰的(II类微生物素)。翻译后修饰需要产生修饰核糖体翻译的肽的酶。

LAB产生的细菌素通常对其他革兰氏阳性细菌、特别是密切相关的LAB具有活性。同样地，革兰氏阴性细菌产生的细菌素对革兰氏阴性靶菌株有活性。例如，大肠杆菌产生的一种细菌素大肠杆菌素V对多种其他大肠杆菌具有活性。

大肠杆菌素V是从大肠杆菌发现的第一种大肠杆菌素。它是II类微生物素，其作为105个氨基酸的前肽(前导序列+细菌素)合成，其被切割而释放88个氨基酸的成熟肽。大肠杆菌素V操纵子包括结构基因、免疫性基因和两个专门的转运基因。

许多LAB产生细菌素，包括羊毛硫抗菌肽(I类)；非羊毛硫抗菌肽(II类)；和蛋白质(III类)。乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactius subsp.lactis)产生的羊毛硫抗菌肽如乳酸链球菌肽被翻译后修饰并且具有由11种基因组成的遗传操纵子，用于它们的合成、免疫性、修饰和从细胞输出。非羊毛硫抗生素(II类)细菌素在遗传复杂性方面类似于大肠杆菌素V。这些细菌素以前肽产生，其被切割形成成熟的肽并且以与大肠杆菌素V相同的方式从细胞输出，例如，carno细菌素s A和B2、leucocin A和片球菌素PA-1。广布肉杆菌(Carnobacterium divergens)UAL9产生的非羊毛硫抗生素divergicin A的产生和从细胞分泌仅需要两种基因。分泌处于细胞的一般分泌(sec)途径的控制下。Predivergicin A由信号肽和divergicin A组成。一种基因或者核苷酸编码细菌素。另一种基因编码免疫蛋白。

迄今还没有发现LAB产生的细菌素对革兰氏阴性细菌如大肠杆菌有活性。由于下文将变得更显而易见到原因，希望选择产生对一种或多种革兰氏阴性细菌有活性的细菌素的革兰氏阳性宿主。例如，如果将LAB遗传修饰(GMO)以产生细菌素(如大肠杆菌素V)或者对另一种靶细菌有活性的细菌素，那么LAB可以靶定大肠杆菌。

此外，使用表达有效针对革兰氏阴性细菌的细菌素的革兰氏阳性细菌，能够靶定革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，提示可能存在还针对革兰氏阴性细菌导致的任一疾病或者状况的备选或者补充的疗法或者预防性治疗方案。这种状况的实例是断奶后腹泻(PWD)，也称作新生动物泄泻症，其由猪中的大肠杆菌引起。

大肠杆菌PWD或者新生动物泄泻症的爆发是猪生产中出现的问题。PWD或者新生动物泄泻症通常导致受感染的动物的显著的体重减轻。

需要在感染期间促进体重增加或者至少导致体重不进一步减轻的治疗。

II.发明概述

本发明提供了依赖于LAB的使用的技术，所述LAB被遗传修饰(GMO)以产生特异靶定疾病的病原体的异源多肽，如细菌素。本发明的组合物和方法的一种或许多特定用途包括治疗刚断奶的猪中肠毒性大肠杆菌引起的断奶后腹泻(PWD)。

该技术可以应用于革兰氏阳性LAB在特定环境中生长而不导致害处的无论何处。这些环境包括动物饲料，如青贮饲料；发酵的食品和缺氧或者真空包装的食品，如生的和加工的食物、蔬菜和生面团产品；和动物(和人)胃肠道(GI)或者生殖泌尿道。