[发明专利]传感器构建体和检测方法

说明书

本申请要求2004年3月17日提交的、名称为“Novel FluorescentNanosensor Proteins”的美国临时专利申请No.60/554,313的优先权，该申请通过引用被整体并入本文。

背景技术

免疫检验和基于聚合酶链式反应(PCR)的检验是用于检测待分析物的最为广泛使用的技术。虽然基于PCR的技术通常能给出好的检测灵敏度，但是它们并未在很多实验室中广泛用于常规筛选。一个理由是，当PCR用于检测生物材料中的待分析物时，其准确性不仅受PCR检验本身性能的强烈影响，还会被从待测生物材料中提取的核酸品质强烈影响。此外，基于PCR的方法的检测灵敏度会被提取物中干扰扩增过程的抑制剂降低。此外，还需要训练有素的实验室人员来操作PCR检验，以确保其准确性。

免疫检验通常不那么昂贵，也仅需要较少的培训即可操作。它们已以多种不同的形式被采用，其中酶联免疫吸附检验(ELISA)、横向流动免疫检验和Western印记检验是最常用的。但是，目前，ELISA和Western印记技术需要多个孵育步骤，容易出现操作错误。横向流动免疫检验通常更快，但是不如传统ELISA准确。

Tsien et al.提出了另一种检验形式，用于检测待分析物。该技术被描述于美国专利No.5,998,204中，其中使用了具有待分析物结合区域和两个荧光标记的蛋白质。当待分析物结合区域结合上待分析物时，构象变化就会发生，使得两个荧光标记改变相互间的相对位置。这就改变了标记之间的荧光共振能量相互作用，对其进行检测以测定待分析物的结合。

Frommer et al.在PCT国际申请No.03/025220中已经提出了一种类似的检验形式。该检验使用融合蛋白，其包括周质(periplasmic)结合蛋白部分和两个荧光蛋白部分。该融合蛋白在结合待分析物后构象会改变，从而改变了两个荧光蛋白部分的相对位置。由此在荧光蛋白部分之间诱导出了改变的荧光共振能量相互作用。

Tsien和Frommer公开的检验系统都需要使用在结合上目标待分析物时改变构象的传感器构建体。此外，这两者都仅能检测小的待分析物，例如简单的糖和氨基酸。因此，人们仍然需要更为通用的、利用共振能量转移相互作用的检测待分析物的方法，但其不限于必须改变构象以检测待分析物的构建体，或仅能检测小的待分析物的构建体。

发明内容

本发明的检测样品中待分析物的方法涉及使用传感器构建体，所述构建体包括：(i)与待分析物特异性结合的分子识别结构域；(ii)包含RET供体的第一标记；以及(iii)包含针对RET供体的RET受体的第二标记。RET受体与RET供体分开一个距离，该距离允许从供体到受体的Frster共振能量转移得以发生，优选是大约1到大约25纳米的距离。当传感器构建体的分子识别结构域与待分析物结合之后，待分析物与RET供体和/或RET受体的接近干扰了RET供体和RET受体之间的FRET相互作用，产生可被检测到的光学信号。样品中待分析物的存在与否是通过对该光学信号的检测来指示的。

本发明的方法还包括更为具体的步骤：在传感器构建体与样品接触之前，对传感器构建体的RET供体和RET受体之间的Frster共振能量转移相互作用所产生的对照光学信号加以测量，然后对传感器构建体与样品接触之后检测到的光学信号与对照光学信号之间的差异加以测定。该信号和对照光学信号之间的差异代表了样品中待分析物的含量，由此使得可对待分析物进行定量检测。优选地，传感器构建体的荧光或发光的强度和衰减动力学的变化被作为光学信号来测量。

在本发明的方法中，RET供体可以是大量荧光或发光基团中的任何种类，例如，荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光团、非蛋白化学发光化合物以及荧光纳米晶体。RET受体可以是能猝灭(quench)来自RET供体的信号的分子，在一些实施方式中，其展示出增加的、敏化的受体信号。为增加光学信号的强度，可在每个传感器构建体上包括多个RET供体和受体。传感器构建体自身可以是多肽，其可包含抗体或抗体片段，例如抗体的Fv部分。在此类实施方式中，分子识别结构域是传感器构建体的Fv部分的CDR区域。分子识别结构域可以包含金属，例如螯合的金属，或者作为替代，包含寡核苷酸。