[发明专利]非活性型Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα敲入动物以及同样的敲入细胞

说明书

技术领域

本发明涉及非活性型Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CaMKIIα)敲入动物和非活性型Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CaMKIIα)敲入细胞。

背景技术

Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)丰富地存在于中枢神经系统，作为通过将各种各样的蛋白质进行磷酸化而对该蛋白质的功能进行修饰的蛋白激酶(蛋白磷酸化酶)，与神经活动的调控和突触可塑性密切相关。另外，被认为对以学习·记忆为首的高级脑功能、抑制癫痫发作出现、抑制脑缺血时的脑损伤起着重要的作用(参照下面的非专利文献1)。

中枢神经系统中的CaMKII形成由α亚基(CaMKIIα)和β亚基(CaMKIIβ)构成的多聚体结构。这两个亚基同源性高，各自兼有蛋白激酶活性、Ca²⁺/钙调蛋白结合能力、亚基之间的缔合能力。由于α亚基大多出现在前脑，β亚基大多出现在小脑，所以认为上述CaMKII的功能主要是由α亚基承担的。

非专利文献1：《蛋白质核酸酶》Vol.47No.1(2002)51-57页

非专利文献2：Science，Vol.257(1992)201-206页、206-211页

非专利文献3：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.92(1995)6852-6855页

非专利文献4：J.Cereb.Blood Flow Metab.，Vol.16(1996)

发明内容

发明要解决的课题

到目前为止，已报道了制作将CaMK II α蛋白本身去除的单纯敲除小鼠，看到与记忆·学习有关的行动异常和电生理异常，此外也报道了对易痉挛性、脑缺血的脆弱性现象(参照上述非专利文献2、3、4)。然而，在单纯敲除小鼠中，(1)作为将其它蛋白质进行磷酸化的蛋白激酶的功能、(2)与作为Ca2+结合蛋白的钙调蛋白结合的功能、(3)CaMK II亚基之间结合、或与其它蛋白质结合而作为结构蛋白起作用的功能，这些所有功能都丧失了，通过敲除小鼠看到的各种异常是由(1)～(3)中哪一种功能丧失引起的并不清楚。另一方面，使用培养神经细胞或脑切片的实验表明，(1)的作为蛋白激酶的功能更重要。

因此，为了对CaMK II的上述(1)～(3)的功能进行区别研究，制作只有(1)的功能被特异地阻碍了的特异性高的功能阻碍动物(所谓的“功能性敲除动物”)并进行解析，这对阐明脑功能的分子机制和精神神经疾病的病理学很有必要。

本发明正是着眼于上述的问题而进行的，其课题是提供一种将CaMK II α基因置换为非活性型、只有CaMK II α的蛋白激酶活性被特异地损伤了的非活性型CaMK II α敲入动物和非活性型CaMK II α敲入细胞。

用于解决课题的手段

鉴于上述课题，本发明人使用基因工程和发育工程上的手法，新制作了将CaMK II在前脑的主要亚基α置换为非活性型的敲入型基因改变的小鼠，并进行了解析，结果完成了本发明。

即，作为产业上和医疗·医学研究上有用的发明，本发明包括 以下A)～I)的发明。

A)一种非活性型CaMK II α敲入非人动物，其特征在于，通过将同源染色体的一方或双方的Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II α(CaMK II α)基因置换为非活性型，改变为表达非活性型CaMK II α。其中，所谓“非活性型CaMK II α”是指：CaMK II α作为蛋白被表达、并保持钙调蛋白结合能力等，但其蛋白激酶(蛋白磷酸化酶)活性被特异地损伤(消失或显著降低)。可以是同源染色体的一方被非活性型CaMK II α置换的杂合体动物，也可以是双方被置换的纯合体动物。

B)一种上述A)所述的非活性型CaMK II α敲入非人动物，其特征在于，由通过基因打靶法制作的。如后述那样，在该基因打靶法中，为了置换为非活性型CaMK II α，包括通过同源重组将基因组中的CaMK II α基因的编码区域中的一部分置换为其它碱基序列的工序。