[发明专利]检测、鉴定和定量大环内酯及其杂质的方法与系统

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2004年5月6日提交的美国系列号60/568,637的优先权，其内容全文纳入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及检测、鉴定和定量大环内酯，例如红霉胺和相关化合物的分析方法与系统，包括反相高效液相色谱(RP-HPLC)和电化学检测或质谱检测。

发明背景

大环内酯是用于治疗各种细菌感染的抗生素家族。大环内酯的化学特征在于14到16个原子和一般至少一个侧挂糖(pendant sugar)、氨基糖或相关部分组成的大环内酯环结构。据信，大环内酯与细菌50S核糖体上的两个位点结合导致转移RNA解离和肽连接终止，从而抑制了细菌蛋白质合成。红霉素是于1952年发现的第一个大环内酯类抗生素并且很快进入临床使用。红霉素和早期的衍生物(例如，不同的盐和酯)的一般特征在于对大多数革兰阳性细菌，特别是链球菌具有抑菌或杀菌活性，以及对呼吸道病原体具有良好活性。已证实大环内酯对许多呼吸道感染安全有效，并可用于青霉素过敏的患者。

大环内酯一般在非常低的波长范围(例如，＜220nm)具有紫外(UV)吸收，这接近光度检测方法的极限。红霉素(结构见下文)的美国药典国家处方集(USP-NF)的法定试验方法包括利用215nm紫外检测以L21固定相(反相，刚性，球状苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，5到10μm粒径)进行的RP-HPLC(参见，例如2000年1月1日出版的USP-NF的第663-665页)。事实上，许多还原的红霉素衍生物和相关分子，例如9-(S)-红霉胺(erythromycylamine)(eryamine或PA2794，结构见下文)在远低于215nm具有最大紫外吸收带(UV_max)。例如，9-(S)-红霉胺的UV_max发生在约191nm，这接近标准光度检测方法的短波长极限。因此，例如电化学检测质谱检测方法的替代检测方法是有吸引力的(参见，例如Whitaker等，J.Liq.Chromatogr.，(1988)，11(14)，3011-20；Pappa-Louisi等，J.Chromatogr：，B：Biomed.Sci.Appl.，(2001)，755(1-2)，57-64；Kees等，J.Chromatogr.，A(1998)，812(1+2)，287-293；Hedenmo等，J.Chromatogr.，A(1995)，692(1+2)，161-6；Daszkowski等，J.Liq.Chromatogr.Relat.Technol.，(1999)，22(5)，641-657和Dubois等，J.Chromatogr.，B：Biomed.Sci.Appl.，(2001)，753(2)，189-202)。然而，这些替代方法主要设计用于检测生物基质，例如血浆或其它生物物质中的大环内酯，其并未优化用于将基本纯的大环内酯(用作，例如活性药物成分(API))与较低含量的杂质分开，而许多这些杂质是具有类似物理性质的相关大环内酯。

              红霉素              9-(S)-红霉胺

因为检测、鉴定和定量大环内酯样品中的杂质是质控所必需的，特别是当该大环内酯是API时所必需的，目前需要适当地设计利用HPLC试验方法来检测、鉴定和定量大环内酯，例如9-(S)-红霉胺及其杂质的试验(方法)。本文所述的方法和系统有助于满足这些与其它需求。

发明概述

本发明提供检测测试样品中的大环内酯的方法，其中该测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，该方法包括：

a)将该测试样品施加至反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；

b)用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇类的梯度流动相洗脱该测试样品；和

c)用电化学检测器或质谱检测器监测柱的流出液以分别检测对应于该大环内酯的电流峰或质量峰。

本发明还提供测定测试样品的纯度的方法，其中该测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，该方法包括：

a)将该测试样品施加至反相高效液相(RP-HPLC)色谱柱；

b)用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇类的梯度流动相洗脱该样品；

c)用电化学检测器监测柱的流出液，以检测：

i)对应于该大环内酯的电流峰；和

ii)任选的一个或多个对应于该测试样品中的一种或多种杂质的其它电流峰；和

d)测定该检测器所检测的电流峰的一种或多种特性来计算该测试样品中的杂质含量。