[发明专利]在芽孢杆菌细胞中生产透明质酸的方法

权利要求书

1.生产透明质酸的方法，包括：

(a)在有助于生产透明质酸的培养基中培养芽孢杆菌细胞，其中芽孢杆菌细胞包含含有三联启动子的核酸构建体，三联启动子包含具有对应于SEQ ID NO：1的位置590的突变的变体amyL启动子，”-35”区域具有TTGACA序列和”-10”区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连；和

(b)从培养基中分离透明质酸。

2.权利要求1的方法，其中变体amyL启动子是SEQ ID NO：1。

3.权利要求1的方法，其中共有启动子是从任何细菌启动子获得的。

4.权利要求1的方法，其中共有启动子是从芽孢杆菌启动子获得的。

5.权利要求1的方法，其中共有启动子是从由大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌亚种tenebrioniscryIIIA基因或其部分，或者原核生物的β-内酰胺酶基因获得的启动子中得到的。

6.权利要求1的方法，其中共有启动子是从解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)中获得的。

7.权利要求6的方法，其中共有amyQ启动子具有SEQ ID NO：42或SEQIDNO：43的核苷酸序列。

8.权利要求7的方法，其中共有amyQ启动子具有SEQ ID NO：42或SEQIDNO：43的核苷酸86-185的核苷酸序列。

9.权利要求1的方法，其中cryIIIA启动子是从苏云金芽孢杆菌亚种tenebrionis获得的。

10.权利要求1的方法，其中核酸构建体更进一步地包含位于三联启动子下游和一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上游的mRNA加工/稳定序列。

11.权利要求10的方法，其中mRNA加工/稳定序列是cryIIIA mRNA加工/稳定序列。

12.权利要求10的方法，其中mRNA加工/稳定序列是SP82mRNA加工/稳定序列。

13.权利要求1的方法，其中芽孢杆菌细胞包含一个或多个拷贝的核酸构建体。

14.权利要求1的方法，其中芽孢杆菌细胞包含一个拷贝的核酸构建体。

15.权利要求1的方法，其中核酸构建体更进一步地包含可选择的标记基因。

16.权利要求1的方法，其中芽孢杆菌细胞不包含外来的可选择标记基因。

17.权利要求1的方法，其中涉及透明质酸生物合成的一个或多个编码序列选自由类透明质酸合酶、UDP-葡萄糖6-脱氢酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、己糖激酶、葡糖磷酸变位酶、酰胺转移酶、变位酶和乙酰转移酶基因组成的群组。

18.权利要求1的方法，其中核酸构建体包含在芽孢杆菌细胞的染色体中。

19.权利要求1的方法，其中核酸构建体包含在染色体外元件中。

20.权利要求1的方法，其中芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金杆菌细胞。

21.权利要求1的方法，其中芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

22.权利要求1的方法，其中芽孢杆菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞。