[发明专利]在芽孢杆菌细胞中生产透明质酸的方法

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及在细菌细胞中生产透明质酸的方法。

相关技术的描述

透明质酸是由通过交替的β-1，4-和β-1，3-糖苷键连接在一起的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单位组成的未硫酸化的糖胺聚糖。已经鉴定透明质酸在体内的许多作用(参见，Laurent T.C.andFraser J.R.E.，1992，FASEB J.6：2397-2404和Toole B.P.，1991，＂Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation.＂In：CellBiology of the Extracellular Matrix，pp.305-341，Hay E D.，ed.，Plenum，NewYork)。透明质酸存在于透明软骨、滑膜关节液体和皮肤组织中，在真皮和表皮中都存在。怀疑透明质酸在许多生理机能，例如粘附、发育、细胞运动性、癌症、血管发生和伤口愈合中起作用。由于透明质酸独特的物理和生物学特性，已经在眼睛和关节手术中使用它。也已经研究出供整形外科、风湿病学和皮肤病学使用的透明质酸产物。

公鸡冠已经是透明质酸的常规来源。但是，利用含有生物合成透明质酸的基因的重组微生物正作为一种替换方式出现。

已经很好地确定芽孢杆菌(Bacilli)是生产天然和重组蛋白质的宿主细胞系统。美国专利申请No.2002/0160489公开了包含酿脓链球菌(Streptococcuspyrogrnenes)类透明质酸合酶和UDP-葡糖脱氢酶基因中的一个或两个基因的三个枯草芽孢杆菌菌株的构建。美国专利申请No.2003/0092118描述了利用包含启动子控制下的来自类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓性链球菌(Ptreptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、出血败血性巴斯德(氏)菌(Pasteurella multocida)、Sulfolobus solfactaricus、炭疽芽孢杆菌pXO1(Bacillus anthracis pXO1)、小球藻病毒(Chlorella virus)或长囊水云病毒(Ectocarpus siliculosus virus)的生产透明质酸的类透明质酸合酶基因的重组芽孢杆菌宿主细胞的用途。WO 03/054163公开了通过培养包含含有类透明质酸合酶编码序列的核酸构建体的芽孢杆菌宿主细胞生产透明质酸的方法，其中类透明质酸(hyaluronan)合酶编码序列可操作地与类透明质酸合酶编码序列的外来启动子序列连接。

美国专利Nos.6,255,076和5,955,310描述了供在芽孢杆菌细胞中表达酶所用的串联启动子，构建体和方法。其中也描述了利用cryIIIA稳定序列改进芽孢杆菌中生产的情况。WO 03/095658公开了由amyL4199、短共有amyQ和cryIIIA启动子序列组成的三联启动子。

提供在芽孢杆菌菌株中生产透明质酸的改进方法是本发明的目标。

发明概述

本发明涉及生产透明质酸的方法，包括：(a)在有助于生产透明质酸的培养基中培养芽孢杆菌宿主细胞，其中芽孢杆菌细胞包含含有三联启动子的核酸构建体，三联启动子包含具有对应于SEQ ID NO：1的位置590的突变的变体amyL启动子，”-35”区域具有TTGACA序列和”-10”区域具有TATAAT序列的共有启动子和cryIIIA启动子，其中三联启动子的每个启动子序列可操作地与一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列相连；和(b)从培养基中分离透明质酸。在优选方式中，核酸构建体更进一步地包含位于三联启动子下游，一个或多个涉及透明质酸生物合成的编码序列上游的mRNA加工/稳定序列。