[发明专利]蛋白质分离的方法无效

专利信息
申请号: 200580026695.X 申请日: 2005-06-06
公开(公告)号: CN101111511A 公开(公告)日: 2008-01-23
发明(设计)人: A·利赫姆 申请(专利权)人: AVT血浆有限公司
主分类号: C07K1/14 分类号: C07K1/14;C07K1/22;C07K14/81;C07K14/745;C07K14/755;C07K14/765;C07K16/00;B01D15/08
代理公司: 北京北翔知识产权代理有限公司 代理人: 张广育;姜建成
地址: 澳大利亚*** 国省代码: 澳大利亚;AU
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摘要:
搜索关键词: 蛋白质 分离 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及从生物源分离蛋白质的方法。更具体而言,本发明涉及从血液中分离蛋白质的方法。

背景技术

血浆是自然界最有价值的原材料之一,并且从血浆中纯化的蛋白质是全世界许多个体的生命和健康所必需的。这其中的大部分蛋白质由Cohn冷乙醇沉淀分级分离法生产。该方法由哈佛大学的Edwin Cohn博士在20世纪40年代早期开发。Cohn发现可根据不同条件(pH、离子强度、蛋白质浓度、温度和乙醇浓度)下蛋白质的沉淀特征分离血浆中的蛋白质。通过改变这些参数,不同蛋白质以分步方式沉淀出来。Cohn技术已用于血浆工业数十年,但是该方法在纯度和效率方面存在一些局限性。尽管该方法可生产一定品质的产品,但是在步骤的灵活性和所生产产品的纯度上存在局限性。商业上最为常见的依然使用该方法生产的蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、抗凝血酶III、凝血酶和血纤蛋白原。

生产血浆产品的一类技术进步包括层析的使用,该层析分离血浆中的蛋白质是基于液体(流动相)渗透过含固定相的封闭柱时,蛋白质分子选择性吸附到固定固体表面(固相)。根据吸附或相互作用的效率,不同蛋白质的运动被不同程度地延缓,这使其能从柱底实现分离并收集。

层析本质上是较传统的Cohn冷乙醇法更为温和的分离蛋白质的手段,Cohn冷乙醇法使得蛋白质暴露在高浓度乙醇中的时间更长。这就会使蛋白质变性并产生所不需要的聚集物,这转而对接受这些产品的患者有着不利治疗后果。相反,层析分级分离可有效除去杂质,而不影响到蛋白质的天然结构。与Cohn冷乙醇分级分离法中所涉及的反复大规模沉淀相比,层析是一种更直接的分离方法,它能提高每升血浆所生产的蛋白质的量。

迄今为止已被采用的层析法在使产率最优化同时维持或提高必要的纯度水平方面仍具有挑战性。仍然需要有效且高性价比的层析技术,该层析技术以相对于现有方法以更高的纯度和产量选择性洗脱血浆组分。

20世纪60年代早期,人们注意到低温孵育血浆时,可观察到有沉淀物形成。已证实该沉淀物含有因子VIII、Von Willebrand因子和许多其它血浆蛋白质。最初该冷沉淀物被用于治疗A型血友病患者,但是需要提高患者对该产品的耐受性,可采用纯度更高形式的因子VIII。冷沉淀方法仍然是现今工业使用的因子VIII生产的首要基础。不幸的是,该方法效率不高,并且尽管已进行多种尝试通过直接使用血浆而非冷沉淀物提高因子VIII的回收,但是这其中很少有尝试在商业上获得成功。

因子IX用于治疗B型血友病患者,它从上清液I——完善的Cohn血浆分级分离法的副流分——中分离出。在基本所有的现有制备方法中,上清液I中的因子IX通常采用亲合层析步骤使用肝素琼脂糖凝胶(Heparin Sepharose)进一步纯化,但是由于整个方法是以Cohn分经分离为基础,所以在制备效率上依然存在着显著的局限性。

在这种情况下,仍需要从含有因子VIII和/或因子IX的混合物中分离因子VIII和/或因子IX的更为有效的方法。

发明内容

根据第一方面,本发明提供了一种从含有蛋白质的溶液中分离所述蛋白质的方法,所述溶液选自粗制血浆、血清、来源于血浆的冷上清液、分级分离的人血浆、来源于血浆的冷沉淀物和重组肉汤(recombinantbroth),所述方法包括:

(i)提供具有下式的固体分离介质:

M-S-L

其中M为基质骨架,S为任选的间隔臂,L是配体巯基烟酸;

(ii)将所述固体分离介质与所述溶液相接触,这样至少一种所述蛋白质可逆地结合到所述固体分离介质上;

(iii)进行至少一步洗脱以从该固体分离介质上选择性洗脱至少一种蛋白质流分。

下列特征涉及本发明的第一方面。

在一个实施方案中,蛋白质为哺乳动物源的或人源的。

间隔臂S可来源于含有环氧基的化合物(如丁二醇二环氧甘油醚(butane dioldiglycidylether)或表氯醇)或其它合适的本领域已知的用于共价连接配体的偶联剂。

基质骨架M可为树脂,由此该固体分离介质为与配体起作用的树脂。另外,该树脂可为配体可与其连接的任何树脂。更进一步,该树脂可为适于诸如流化床吸附和膨胀床吸附的非填充床吸附的高密度树脂,例如以6%或4%琼脂糖为基础的高度交联微球样琼脂糖衍生物、琼脂糖-碳化钨凝聚物、琼脂糖不锈钢凝聚物、琼脂糖-石英凝聚物、多孔陶瓷微球、多孔氧化锆微球、控孔玻璃制成的微球以及其孔中含有有机聚合物的多孔无机材料复合微球。

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