[发明专利]毒素中和性肽的筛选方法和STX2抑制性肽以及Vero毒素中和剂

说明书

技术领域

本发明涉及能够抑制Vero毒素或者霍乱毒素、百日咳毒素等毒素的毒素中和性肽的筛选方法。 

此外，本发明还涉及STX2抑制性肽和Vero毒素中和剂。此外，更具体地讲，涉及竞争性地抑制Vero毒素向细胞的附着、能够有效地抑制Vero毒素的STX2抑制性肽、和能够经口给予的新型的Vero毒素中和剂。 

背景技术

肠道出血性大肠杆菌0157：H7产生的Vero毒素是属于与来自赤痢菌的志贺毒素类似的细菌毒素的AB₅家族的蛋白质，已知这些毒素，识别各种目的脏器的血管内皮细胞上的球丙糖酰基鞘氨醇(globotriaosylceramide，Gb3，Galα-4Galβ1-4Glcβ1-Cer)中的globo三糖部分，通过附着摄取到细胞内，显示出毒性。 

并且，这样的志贺样毒素存在2种，这些毒素能够引起毒素出血性大肠炎或者其后的一系列的微小血管障碍这样的严重并发症(例如：溶血性尿毒综合症(HUS))等。作为STX1所表示的毒素，与志贺氏赤痢菌(Shigella dysenteriae TypeI)产生的志贺毒素具有相同的氨基酸序列。另一方面，STX2所表示的毒素被认定与STX1具有50％～60％的氨基酸序列一致性。它们的毒性虽然在它们的氨基酸序列上稍有差别，不过通过蛋白质合成抑制展示出细胞毒性或者肠道毒性等活性。Stx是由2种亚单位(A和B)构成的AB₅型的毒素，1分子的A亚单位周围通过疏水键包围着5分子的B亚单位。承担毒素活性的是A亚单位，B亚单位承担着与细胞表层上存在的糖链受体结合的作用。通过毒素的X射线结 晶结构分析等得到详细的研究可知，在1分子的B亚单位中存在3个糖链结合部位。即，根据在1分子的STX2中存在5分子的B亚单位，可以推测能够提供共计15个结合部位。 

即，STX分类成STX1和STX2的两个家族，引起严重综合症的几乎都是STX2产生菌，在临床上STX2这一方面更加重要。所以，当务之急是开发针对STX2的抑制剂。这些STX以A-B₅型毒素形式，其中的B亚单位通过与细胞膜上的受体Gb₃(globotr iaosylceramide：Ga lα(1-4)-Galβ(1-4)-Glcβ1-Ceramide)的结合被摄取到细胞内部。此外，B亚单位五聚体特异地识别Gb3的糖链部分(Globo三糖：Galα(1-4)-Galβ(1-4)-Glcβ1-)。所以，Globo三糖的高密度聚集的化合物能够以高亲和力结合STX，成为抑制其作用的STX抑制剂。 

随着这样的毒素的亚单位构成及其功能的阐明，选择性地抑制具有向细胞表层上的糖链受体的结合功能的B亚单位结合的方法引人关注，开展了从各种观点出发的研究。 

本申请的发明人也进行了能对如前所述的毒素的糖链结合部位有效地进行糖链结合的、抑制毒素向宿主细胞粘附的人工糖链簇的构建。并且，到现在为止，提出了以碳硅烷为糖链承载骨架的枝型化合物群，或者水溶性聚合物化合物(专利文献1～2，非专利文献1)。 

例如，下式所示的SUPER TWI G(1)6等。该物质是首次在0157：H7感染实验中被证明有效的化合物。

包括SUPER TWIG，到目前为止STX抑制剂的开发是根据下述理念进行的：为了使之在生物体内发挥抑制活性，着眼于如何使作为STX结合单位的globo三糖积聚。可是，globo三糖单独对STX的亲和性(Kd)是10^-3M，不一定高，而且化学合成极其困难。这成为临床应用的最大障碍。所以，为了进行能够临床应用的治疗药物开发，有必要开发比globo三糖更容易合成的、对STX的结合能力优良的新型的STX结合单位。 

并且，推测上述那样的课题并非Vero毒素所特有的，而是被认为是Vero毒素STX以外的、在受体结合部具有亚单位结构的霍乱毒素(A-B5型)受体：GM1、毒素原性大肠杆菌易热性痢疾的致病毒素LT(A-B5型)受体：GM1、百日咳毒素(A-B5型)受体、炭疽菌毒素(7聚体型)受体：具有VWA结构域的蛋白(anthrax toxin receptor)等的情况下共有的。 

在这样的情况下，本申请的发明人进行了构建这些毒素的受体的处方物质的研究 

专利文献1：WO02/02588 

专利文献2：特愿2004-108483号申请 

非专利文献1：Proc.Natl.Acad.Sci.USA2002；99：7669-74