[发明专利]细胞周期阶段标志物

说明书

技术领域

本发明涉及细胞周期阶段特异性标志物以及用于确定哺乳动物 细胞中细胞周期不同阶段之间的转变的方法。

发明背景

真核细胞分裂通过高度受控的包括称为G1、S、G2和M的连续 阶段的细胞周期来进行。细胞周期或细胞周期控制的破坏可导致细胞 异常或疾病状态诸如癌症，这起因于多种遗传改变，其将生长受限的 细胞转化成了高度侵入性的细胞，它们对生长的正常控制没有应答。 正常细胞到癌细胞的转变可通过DNA复制和DNA修复机制的正确 功能的丧失而产生。所有分裂中的细胞都受控于许多控制机制，称为 细胞周期关卡，其通过停滞异常细胞或诱导异常细胞的破坏来维持基 因组完整。因此对细胞周期进展和控制的研究对于设计抗癌药物来说 是有相当重要性的(Flatt,P.M.和Pietenpol,J.A.Drug Metab.Rev., (2000),32(3-4),283-305；Buolamwini,J.K.Current Pharmaceutical  Design,(2000),6,379-392)。

细胞周期进展是通过许多细胞周期调节剂的规定时间和空间表 达、定位以及破坏来严格控制的，它们在细胞周期期间呈现高度的动 态性(Pines,J.,Nature Cell Biology,(1999),1,E73-E79)。例如，在特 定的细胞周期阶段，一些蛋白质从细胞核易位到细胞质，或者相反， 以及一些蛋白质被迅速降解。要了解已知细胞周期控制成分和相互作 用的细节，参见Kohn,Molecular Biology of the Cell(1999),10, 2703-2734。

细胞周期状态的准确确定是研究影响细胞周期或依赖于细胞周 期位置的细胞过程的关键要求。这些测定在药物筛选应用中是特别至 关重要的，其中：

i)需要直接或间接改变细胞周期进展的物质，例如用于作为潜在 的抗癌治疗的研究；

ii)检查候选药物对细胞周期进展的有害影响；和/或

iii)怀疑试剂对特定细胞周期阶段的细胞是活性的或无活性的。

传统上，细胞群的细胞周期状态是通过流式细胞术确定的，其中 使用荧光染料染色细胞核的DNA(Barlogie,B.et al,Cancer Res., (1983),43(9),3982-97)。流式细胞术产生细胞DNA含量的定量信息， 因此能够确定处于细胞周期的G1、S和G2+M期的相对细胞数量。 然而，该分析是破坏性的非动态的过程，需要细胞群的连续取样来确 定随时间变化的细胞周期状态。流式细胞技术的更多缺点涉及根据 DNA含量间接的和推断性的确定细胞的细胞周期位置。因为细胞核 的DNA含量在整个细胞周期以相当可预期的方式变化，即处于G2 或M的细胞具有G1细胞两倍的DNA含量，处于S期进行DNA合 成的细胞具有中间量的DNA，因此监测细胞在细胞周期不同阶段之 间的相对分布是可能的。然而，该技术不能准确确定任何单个细胞的 细胞周期位置，这是由于将细胞归于G2或M期的不确定性以及由于 细胞群中细胞与细胞之间DNA含量的固有差异所导致的进一步的不 准确，这可能排除了与细胞周期相邻期之间的边界处相接近的细胞之 间的准确区分。此外，不同组织或生物的不同细胞类型之间的DNA 含量和DNA染色的差异要求该技术对每种细胞类型进行优化，可能 使得细胞类型之间或实验之间的直接数据比较复杂化(Herman, Cancer(1992),69(6),1553-1556)。因此流式细胞术适合于检查细胞群 中细胞的整体细胞周期分布，但是不能用于监测单个细胞随时间变化 的准确细胞周期状态。

EP 798386描述了用于分析异质细胞样品中存在的细胞亚群的细 胞周期的方法。该方法使用的是用荧光标记的单克隆抗体连续温育样 品以鉴别特异性结合核酸的特定细胞类型和荧光染料。这使得能够确 定样品中存在的细胞亚群的细胞周期分布。然而，由于该方法利用了 流式细胞术，因此它仅产生非动态数据，需要在暴露于所研究的试剂 之后，在单独的细胞样品上进行连续测定来确定细胞群的细胞周期状 态随时间的变化，以确定对细胞周期进展的影响。