[发明专利]多RNA聚合酶Ⅲ启动子表达构建体

说明书

与相关申请的交互引用

本申请要求2004年8月23日提交的美国临时申请No.60/603,622、和2004年11月22日提交的美国临时申请No.60/629,942的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本申请。

技术领域

本发明的通用领域是新的重组DNA分子的使用方法和组合物，所述重组DNA分子具有能有效地指导(在细胞、组织或生物体内)大量产生小的、经遗传学加工的RNA分子的能力，所述RNA分子能用于抑制涉及疾病或异常细胞功能的基因。具体地，本发明提供了用于利用适用于人类治疗性应用的设计从单个重组DNA分子中同时产生多个(2、3、4、5或更多个)不同的小RNA分子的方法。

背景技术

最近，已经认识到了RNAi或双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默现象，其中与细胞内或生物体内的靶基因的一个区域互补的dsRNA抑制了靶基因的表达(见例如Fire等的1999年7月1日公开的WO 99/32619；美国专利6,506,559：“双链RNA的遗传抑制”；Pachuk和Satishchandran的WO 00/63364：“用于抑制多核苷酸序列的功能的方法和组合物”；以及2002年10月18日提交的美国临时申请No.60/419,532(2004年4月29日公开的WO2004/035765：“双链RNA结构和构建体、以及产生和使用相同的双链RNA的方法”))。双链RNA(dsRNA)基因沉默提出了在基于核酸的技术方面中的特别令人兴奋的潜在应用。双链RNA已经显示出能诱导多种不同生物体体内的基因沉默。基因沉默可以通过不同的机制发生，其中一种是转录后基因沉默(PTGS)。在转录后基因沉默中，靶基因座的转录是不受影响的，但是缩短了RNA的半衰期。外源性RNA已经显示出作用为植物和动物(包括线虫、锥虫、昆虫、和哺乳动物)中的PTGS的强诱导剂。转录基因沉默(TGS)是调节基因表达的另一种机制。在TGS中，基因转录受到了抑制。在PTGS中，沉默复合物装置位于细胞的细胞浆内。在TGS中，效应dsRNA在细胞的核部分是有表面活性的。对于研究性的、治疗性的、和预防性的适应症而言，利用dsRNA介导的基因沉默的能力都是巨大的。靶mRNA降解的精确的序列特异性以及与PTGS相关的系统性能都使得这个现象用于功能基因组和药物开发都是非常理想的。

目前一些用于利用dsRNA沉默脊椎动物细胞的基因的方法造成了不需要的非特异的细胞毒性或细胞死亡，因为dsRNA介导的应激应答包括白介素应答。早期报道明确地提出了脊椎动物中的dsRNA介导的毒性仅仅与长度大于30bp的dsRNA有关，而与siRNA(21-23个bp的短的合成的双链dsRNA分子)或其它的小于30bp的双链dsRNA无关。尽管早先都接受这种观点，但是最近的报道认为外源性引入的siRNA分子也能发生非特异的沉默效应和其它的毒性，包括诱导细胞应激应答途径例如干扰素应答。但是，申请人已经证实在不触发dsRNA介导的毒性的条件下可以实现细胞内表达来自核酸表达构建体的dsRNA分子，包括所报道的能诱导脊椎动物细胞毒性的长dsRNA。见例如已公开的Satishchandran、Pachuk、和Giordano的美国专利申请No.2004/0152117。因此，长的和短的dsRNA分子(包括dsRNA发夹分子)都可以用于哺乳动物和其它脊椎动物，且不会诱导干扰素或其它dsRNA介导的应激应答，条件是dsRNA分子是在宿主细胞内表达的，而不是外源性地引入到细胞内的。但是，仍存在着挑战，实际完成这些dsRNA方法要求在细胞内从dsRNA表达构建体中有效地产生并输送dsRNA分子。

对于RNAi应用以及核酸在生物学活性的其它机制方面的用途，常常需要从核酸表达构建体中细胞内地表达生物学活性核酸。这些方法的有效性都依赖于在靶宿主细胞内以治疗相关的方式有效表达选定核酸的能力，例如对体内或体外的所需靶细胞为生物学活性的、无毒的形式，以及在所需亚细胞部位中的有效量和持续时间。这都给难以转染的和体内应用的细胞带来了特殊的挑战，例如原代细胞、某些细胞株例如K5625(一种人白血病细胞株)。在真核细胞内，从核酸表达载体中细胞内表达核酸需要改良的表达系统、表达构建体和方法。希望这些方法能用于提供能够实现它们的各种生物功能中的任一功能的核酸，包括在体外样品、细胞培养物和完整动物(例如脊椎动物例如哺乳动物包括人)中产生所需的多肽和/或所需的RNA效应分子例如核酶、反义RNA、三链RNA、和/或dsRNA。