[发明专利]浓缩分泌的重组蛋白的方法和组合物

权利要求书

1.克鲁维酵母细胞制备物，特征在于壳多糖酶阴性表型，其中所述表型是编 码分泌的壳多糖酶的壳多糖酶基因中的突变的结果，所述制备物能够生长至与野 生型克鲁维酵母细胞相似的细胞密度。

2.根据权利要求1的克鲁维酵母细胞制备物，还能够表达和分泌重组蛋白。

3.根据权利要求2的克鲁维酵母细胞制备物，其中所述表达由LAC4启动子 或其修饰物调节。

4.根据权利要求1的克鲁维酵母细胞制备物，包括穿梭载体，所述穿梭载体 具有修饰的Lac4启动子，用于在克鲁维酵母中表达蛋白质而在大肠杆菌中不表达 蛋白质。

5.根据权利要求2的克鲁维酵母细胞制备物，其中所述穿梭载体是pKLACI。

6.根据权利要求1的克鲁维酵母细胞制备物，还包括培养基，在所述培养基 中，所述克鲁维酵母至少能够生长或维持，所述培养基还包括无菌壳多糖。

7.根据权利要求6的克鲁维酵母细胞制备物，其中所述无菌壳多糖是磁珠形 式。

8.根据权利要求1的克鲁维酵母细胞制备物，其中所述制备物包含在容器中， 所述容器任选地含有磁体或与磁体接触，用于可逆地结合所述壳多糖珠。

9.得到分泌的重组蛋白质的浓缩制备物的方法，包括：

(a)用含有DNA的载体转化权利要求1-8任一项所述的克鲁维酵母细胞制备 物，所述DNA编码包括壳多糖结合结构域(CBD)和目标蛋白的融合蛋白；

(b)在所述克鲁维酵母细胞中表达所述融合蛋白，并从所述克鲁维酵母细胞 分泌所述融合蛋白；和

(c)通过CBD将所述的分泌的融合蛋白结合到壳多糖制备物，以便得到所述 分泌的重组蛋白的浓缩制备物。

10.根据权利要求9的方法，其中步骤(a)中的所述载体是穿梭载体。

11.根据权利要求10的方法，其中在所述载体中编码所述目标蛋白的所述 DNA在大肠杆菌(E.coli)中转录是沉默的，在所述克鲁维酵母细胞中转录是活化 的。

12.根据权利要求10的方法，其中所述穿梭载体具有修饰的LAC4启动子。

13.根据权利要求12的方法，其中所述穿梭载体是pKIAC1。

14.根据权利要求11的方法，其中所述克鲁维酵母是马克斯克鲁维酵母脆壁 变种(Kluyveromyces marxianus variety fragilis)或乳酸变种(Kluyveromyces marxianus  variety lactis)。

15.根据权利要求9的方法，其中所述克鲁维酵母细胞处于培养中，因而所 述融合蛋白被分泌到所述培养基中。

16.根据权利要求15的方法，还包括：在培养期间将壳多糖加入所述培养基。

17.根据权利要求16的方法，其中所述壳多糖是无菌的。

18.根据权利要求15的方法，其中所述壳多糖被加入所述培养基。

19.根据权利要求9或17的方法，其中所述壳多糖是选自涂层、胶体、珠、 柱、基质、片层或膜的形式。

20.根据权利要求9或17的方法，其中所述壳多糖是壳多糖珠，所述珠或是 有孔的或是无孔的。

21.根据权利要求20的方法，其中所述壳多糖珠被磁化。

22.根据权利要求21的方法，其中回收与所述壳多糖结合的融合蛋白还包括 施加磁力的步骤(d)。

23.根据权利要求9的方法，其中所述融合蛋白和壳多糖的所述结合是可逆 的，因而在不同于结合条件的非变性条件下，所述融合蛋白可以从所述壳多糖释 放。

24.权利要求9所述的得到分泌的重组蛋白质的浓缩制备物的方法，其中所 述载体是穿梭载体，其中所述穿梭载体(i)能够整合到酵母宿主细胞的基因组中， 和(ii)含有DNA，所述DNA编码含有壳多糖结合结构域和目标蛋白的融合蛋白。