[发明专利]浓缩分泌的重组蛋白的方法和组合物

说明书

背景技术

壳多糖(几丁质，chitin)，一种N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的β-1，4-连接 的无支链共聚物，构成了地球上继纤维素之后第二大最丰富的聚合物。它是昆虫 外骨骼(Merzendorfer，H.，et al.，J.Exptl.Biol.206：4393-4412(2003)，无脊椎动物甲 壳类的外壳和真菌细胞壁(Riccardo，A.，et al.″Native，industrial and fossil chitins，″in Chitin and Chitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub.Birkhauser Verlag： Basel，Switzerland(1999))的主要成分。壳多糖酶水解壳多糖的β-1，4-糖苷键，并且 已经在原核生物、真核生物和病毒生物体中发现。在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，壳多糖酶在有效的细胞分离方面具有形态学作用(Kuranda，M.，et al.J. Biol.Chem.266：19758-19767(1991))。此外，植物表达壳多糖酶以抵抗含壳多糖的 病原体。实际上，壳多糖基因在转基因植物中的异源表达已显示出增加对某些植 物病原体的抗性(Carstens，M.，et al.Trans.Res.12：497-508(2003)；Itoh，Y.，et al. Biosci.Biotechnol.Biochem.67：847-855(2003)；Kim，J.et al.Trans.Res.12：475-484 (2003))。根据氨基酸序列相似性，壳多糖酶属于糖基水解酶家族18或家族 19(Henrissat，B.，et al.Biochem.J.293：781-788(1993))。壳多糖酶催化结构域序列的 家族性差异反映了它们不同的壳多糖水解机制，所述水解引起产物的端基构型或 是保持(家族18)或是翻转(家族19)(Robertus，J.D.，et al.″The structure and action of chitinases，″in Chitin and Chitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub. Birkhauser Verlag：Basel，Switzerland(1999))。

大多数壳多糖酶具有带有各自独立起作用的催化结构域和非催化结构 域的模块结构域组织。O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸区域常常将这两个结构域分 开，并且起到防止壳多糖酶的蛋白水解作用或帮助壳多糖酶分泌的作用(Arakane， Y.，Q.et al.Insect Biochem.Mol.Biol.33：631-48(2003))。根据蛋白质序列相似性， 非催化性壳多糖结合结构域(CBD，也称作ChBDs)属于三个结构类型中的一种(1 型、2型或3型)(Henrissat，B.″Classification of chitinases modules，″，Chitin and Chitinases，ed.P.Jolles and R.A.A.Muzzarelli，pub.Birkhauser Verlag：Basel， Switzerland(1999))。取决于不同的壳多糖酶，CBD的存在可以增强(Kuranda，M.，et al.J.Biol.Chem.266：19758-19767(1991))或抑制(Hashimoto，M.，et al.J.Bacteriol. 182：3045-3054(2000))催化结构域引起的壳多糖水解。