[发明专利]MHC－Ⅱ转基因动物耐受性的研究方法

说明书

本发明涉及用于测试蛋白质变体的免疫原性的体内系统。特别地，本发明涉及使用人类II类MHC分子转基因小鼠的方法，其中使该小鼠对特定蛋白质耐受并然后使用所述特定蛋白质的变体测试免疫原性的诱导。另外，本发明涉及用于从蛋白质变体库中选择免疫原性降低的蛋白质的体内系统，藉此被耐受化的(tolerised)人类MHC转基因小鼠被注射结合有不同变异蛋白质的文库细胞系或颗粒，藉此结合有具有比文库中其他蛋白质更低免疫原性的变异蛋白的特定细胞系或颗粒在体内被选择。 

目前用于测试候选药物蛋白在人类中潜在免疫原性的方法是有限的，主要因为非人类物种具有不同于人类的MHC(主要组织相容性抗原)分子并因此在测试动物中对注入蛋白的免疫应答不反映在人类中对相同蛋白质的预期免疫应答。因此，使用人类细胞或具有人类MHC的细胞来测试蛋白质免疫原性是重要的。一种特别有价值的方法是使用人类血液样品在T细胞增殖测定中测试蛋白质。然而，该方法检测T细胞在体外对受试蛋白质的应答并且迄今还没有产生如体内发生的抗体生成的体外免疫原性方法得到证明。替代方法可以利用使用人类T和B细胞重建的小鼠或转基因小鼠，其中家居(resident)小鼠MHC和在一些情况中的T细胞受体分子已经被它们的人类对应物所取代。然而，这些方法可能不会形成人类中免疫原性的准确预测，因为它们没有考虑耐受性，特别是人类免疫系统对正常人类蛋白的耐受性。例如，人类MHC转基因小鼠将依然预期产生(mount)对抗所注射的人类蛋白的免疫应答，因为所述小鼠将不耐受这样的人类蛋白。因此需要改进的方法以促进蛋白质和蛋白质变体的体内免疫原性的测试，其考虑了在物种中对蛋白质的正常耐受性。 

因此，本发明的第一个方面提供了用于测试从哺乳动物抗原衍生的变异抗原在所述哺乳动物II类MHC分子的非人类转基因哺乳动物中的免疫原性的方法，其中所述非人类哺乳动物不是所述哺乳动物抗原的来源，所 述方法包括： 

(a)通过与所述哺乳动物抗原的接触使所述转基因哺乳动物对所述哺乳动物抗原是耐受的； 

(b)将所述转基因哺乳动物与所述变异抗原相接触；和 

(c)检测所述变异抗原在所述转基因哺乳动物中的免疫原性。 

本发明提供了用于测试蛋白质和蛋白质变体的免疫原性的新型体内系统。如这里所讨论的，变异抗原衍生于哺乳动物抗原。变异抗原可以包括具有增加、缺失或取代的或者通过化学方法衍生的蛋白质或多肽序列。所述抗原不是来源于在该方法中使用的非人类转基因哺乳动物。 

特别地，本发明涉及使用允许展示人类T细胞表位的人类II类MHC分子转基因小鼠并测试小鼠背景中人类蛋白质和蛋白质变体的潜在免疫原性的方法。 

在本发明的一个实施方案中，通过注射低浓度(例如，相当于人类血清和/或其他组织中发现的生理量)蛋白质在表达人类II类MHC(HLA-tg)种系的新生小鼠中诱导对人类蛋白的耐受性。蛋白质优选地是单体的并于免疫“惰性”缓冲液(如盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS))中静脉注入。在这类系统中，诱导耐受性的剂量频率将根据耐受性被诱导针对的蛋白质而不同。例如，正常以高血清浓度存在的蛋白质最可能需要比那些正常以低生理浓度发现的蛋白质更频繁地被注入以诱导耐受性。 

优选地，未成熟小鼠(例如新生小鼠)将被使用以保证耐受化(tolerising)蛋白质存在于T细胞发育并因此诱导中心耐受的过程中。典型地，年龄不超过6周的小鼠将被反复注入，其中来自胸腺的成熟CD4+和CD8+T细胞的生成减少(正常成人期)。具有针对受试蛋白质或受试变异蛋白的不变异形式的已建立的耐受性，被耐受化的小鼠然后将被注射受试蛋白或蛋白变体并随后被检测对抗受试蛋白或蛋白变体的免疫原性。在具有完整的免疫球蛋白基因的小鼠中，免疫原性可以通过针对受试蛋白或蛋白变体的抗体的生成而被检测。或者，与免疫原性有关的其他测定法可以被采用，如使用来自被耐受化的HLA-tg小鼠的外周血液、脾或派伊尔氏斑(Peyer′s Patch)来检测受试蛋白-特异性T或B细胞应答的测定法。