[发明专利]在酮酸存在下的酶促反应

说明书

发明领域

本发明涉及在特定的反应增强化合物的存在下X-Gly至X-α -羟基-Gly或X-NH₂(X是具有甘氨酸基团可以与其共价附着的 羰基的肽或任何化合物)的酶促转化。在优选实施方案中，这些反应 增强化合物是酮酸(或其盐或酯)，它们可以有利地替代过氧化氢酶 使用，所述过氧化氢酶是现有技术这些类型酶促反应，例如酰胺化反 应的一般组分。

相关领域的描述

众多人激素、生长因子、细胞因子、神经递质衍生的脂肪酸和其 他重要的生物学化合物具有氨基酸或肽作为其分子结构的基本部 分。许多疾病对患者中的这些生物学化合物的水平升高呈阳性应答。 可以以多种方式给患者施用治疗上有效量的此类生物学相关化合 物。因此，关于此类化合物的有效的、划算的制造方法是非常重要的。 当生物学化合物以适合于经口递送的剂量形式制备时，这是特别正确 的，所述经口递送的剂量形式是通常优选的施用方式，尽管相对于其 他施用方式生物利用率较低。

哺乳动物细胞和其他真核生物可以执行特定的翻译后加工操 作，而原核生物则不能。某些原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)广 泛用作宿主用于经由重组DNA(rDNA)技术生产哺乳动物蛋白质，因 为它们可以很容易在分批发酵方法中生长，且因为它们在遗传上是充 分表征的。然而，许多哺乳动物蛋白质需要一定类型的翻译后加工。 如果这些蛋白质由例如大肠杆菌基因工程产生，那么翻译后加工通常 必须使用复杂的、体外化学操作来完成，这对于大规模生产应用是成 本高昂的。即使当使用哺乳动物宿主重组生产肽时，通常也需要有效 生产只在稍后对其实施进一步修饰的前体。

一种类型的此类进一步加工活性涉及肽或蛋白质的羧基末端氨 基酸的特异性酰胺化。许多天然存在的激素和肽包含此类修饰，如果 蛋白质将是生物学活性的，那么所述修饰通常是必需的。一个例子是 降钙素，其中用非酰胺化脯氨酸残基替代天然形式的酰胺化脯氨酸导 致生物学活性非常显著的减少。为了完全活性需要翻译后酰胺化的其 他生物学肽包括但不限于生长激素释放因子、其他降钙素、降钙素基 因相关肽、促胰液素、肽YY等。

蛋白质的羧基末端氨基酸的特异性酰胺化通常由α酰胺化酶催 化。为了最大功效需要酰胺化的许多重要的生物学蛋白质的多肽序列 可以例如通过基因工程技术来制造。然而，重要的和有时必需的羧基 末端酰胺化通常必须在体外进行。在这点上需要避免昂贵且繁琐的化 学酰胺化技术，并且因此需要采用酰胺化酶来执行特异性的酰胺化。

肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)催化肽底物转化为酰胺 化的肽产物。该转化是2步反应。PAM具有2个催化结构域：肽基 甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)催化步骤1(底物转化为中间体) 和肽基甘氨酸α-羟甘氨酸α-酰胺化裂合酶(PAL)催化步骤2(中 间体转化为产物)。全长的PAM催化2个步骤。

在自然界中，大约50％的肽激素和神经递质以前述方式由PAM 酰胺化。PAM活性已在众多不同物种中识别出来，并且在不同的物 种如大鼠、母牛和青蛙中往往具有显著的结构同源性。还已知PAM 的功能、底物和辅因子在物种之间是相似的(通常相同)。底物是具 有含有游离羧基的甘氨酸残基的化合物，通常是肽。PAM催化的酰 胺化反应是本领域众所周知的。例如，在美国专利6,103,495中详细 描述了一种反应，其中使用肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶催化甘氨 酸延伸型鲑鱼降钙素前体转化为在其C末端酰胺化的真正的鲑鱼降 钙素(即，具有替代前体C末端甘氨酸的氨基)。

由于酶的失活，PAM的活性在酰胺化反应的过程中迅速减少。 为了预防此类失活，现有技术的酶促酰胺化反应一般需要第二种酶 (例如过氧化氢酶或辣根过氧化物酶)用于良好的转化和反应得率。 然而，这消极影响了该方法的成本和效率，并且从调节立场上通常是 不合需要的。例如，过氧化氢酶是大的蛋白质，它难以纯化，并且它 可能被不需要的蛋白酶污染，所述蛋白酶在酰胺化反应中可以攻击任 何产物、前体和/或酶。在药物产物的情况下与过氧化氢酶共同纯化 的蛋白质还可超过调节标准地污染最终产物。此外，当过氧化氢酶来 自动物来源时，或当过氧化氢酶制造中使用动物组分时，必须特别小 心以避免传染性海绵状脑病。

发明概述