[发明专利]蜜二糖操纵子表达系统

说明书

本发明涉及用于在原核生物宿主中异源表达编码如多肽(如重组蛋白)的核酸的载体。更具体而言，本发明涉及可在宿主中表达的新载体，它含有操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，该转录单元含有对于所述宿主来说是异源的核酸序列，而此核酸序列的表达由该蜜二糖操纵子的所述启动子区域控制。本发明还涉及使用这些载体异源表达编码例如多肽的核酸。

发明背景

已描述了许多用于在原核生物宿主中异源表达编码如多肽(如重组蛋白)的核酸的系统。但是，原核生物宿主系统中的大多数异源基因表达系统全部依赖于有限的细菌启动子组。最常用的原核生物启动子包括乳糖[lac](Yani sch-Perron等，1985，Gene33，103-109)、和色氨酸[trp](Goeddel等，1980，Nature(伦敦)287，411—416)启动子，和衍生自这两种的杂交启动子[tac和trc](Brosius，1984，Gene27：161-172；Amann和Brosius，1985，Gene40，183-190)。其它可诱导的启动子系统，如可由阿拉伯糖诱导的araB启动子(WO8604356)、由L-鼠李糖诱导的鼠李糖启动子rhaSB(WO03068956)或由L-鼠李糖诱导的鼠李糖启动子rhaBAD(WO2004/050877)也已被描述用于蛋白质的异源表达。但是，许多已知用于异源基因表达的原核生物启动子存在各种缺点，例如异源产物对宿主细胞的毒性、产物的低表达率或非功能性聚集体(内涵体)的形成。

还有许多可诱导的启动子系统，它们已用于蛋白质的同源表达中，例如Belyaeva等(2000，Mol.Mi crobiol.，36(1)，211—222)所述的由蜜二糖诱导的蜜二糖操纵子。这类用于同源表达的可诱导启动子系统大多数存在这样的缺点，即诱导率低并因此导致所需同源产物的低表达。此外，这些启动子系统不能被非常严密地调节，因此产生了未诱导状态下的背景活性，这种活性对于严格的表达控制而言是不允许的。例如，Belyaeva等已使用与大肠杆菌(E.coli)的LacZ基因融合的蜜二糖操纵子的不同片段在大肠杆菌中表达β-半乳糖苷酶。但是，产生最高的β-半乳糖苷酶活性的片段(KK43、JK19)也产生了最高的背景活性。

因此，仍需要提供改进的原核生物表达系统，该系统可用来异源表达核酸序列，而不存在上述缺点。

发明概述

通过提供新的载体将可实现依前述说明而显而易见的这些和其它目标，该载体包含用于所需异源产物的高水平表达的原核生物启动子区域。令人惊讶的是，已发现蜜二糖操纵子的启动子区域允许对大量的异源产物的表达进行严密调控。第一方面，本发明的目的是提供可在宿主中表达的新载体，该载体包含操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，其中该转录单元含有对于所述宿主而言是异源的核酸序列，而该核酸序列的表达由该蜜二糖的所述启动子区域控制。还提供的是：所述新载体在原始生物宿主中核酸序列的调节异源表达中的用途；可在宿主中表达的分离纯化的核酸序列，其含有操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，其中所述转录单元含有对于所述宿主而言是异源的核酸序列，而该核酸序列的表达由该蜜二糖操纵子的所述启动子区域控制；用所述载体或所述分离纯化的核酸序列转化的原核生物宿主；和使用所述载体在宿主中生产多肽的方法。

本领域技术人员根据以下的详细描述将更易于了解其它目的和优点，下文的描述将结合以下的阐述性附图以及附带的权利要求进行。

附图简述

图1显示含有蜜二糖可诱导的melAB2启动子(PmelAB2)和转录终止区域(rrnB)的质粒pBLL7。

图2显示了质粒pBLL15，其含有蜜二糖可诱导的启动子(PmelAB2)、编码操作性连接Fab-H片段的重链(phoA-VH-CH)或轻链(ompA-VL3-CL)的信号序列的序列、和转录终止区域(rrnB)。

图3显示使用了不同表达质粒的未诱导的(—)和诱导的(+)W3110株的溶菌酶提取物的斑点印迹结果(采用用于检测Fab的抗人轻链，与碱性过氧化物酶偶联)。显示了时间间隔。

图4显示W3110株(pBLL15)的溶菌酶提取物的蛋白质印迹，其中使用了用于检测Fab且与碱性过氧化物酶偶联的抗人轻链(泳道1：参比Fab-H(2μg)；泳道2：W3110(pBLL15)，诱导的，9小时；泳道3：W3110(pBLL15)，诱导的，12小时；泳道4：W3110(pBLL15)，诱导的，23小时)。