[发明专利]转基因在哺乳动物中枢神经系统中的可调控型表达

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗导入的基因的调控，特定地调控转导进入哺乳动物中枢神经系统(CNS)的转基因的表达。

背景技术

许多人类疾病是由基因的异常表达引起。当基因表达不足时，或当基因产物本身有缺陷时，相应功能基因产物的缺失可通过将丢失的基因产物递送至患者来治疗。然而，蛋白质的递送通常有困难，且仅仅在有限的时间内给予益处，意思指所述蛋白质必须定期地重复再给药，或许需要不定期给药，如在存在慢性疾病的情况下。重复给药费用很高、不方便，并可能由于差的患者顺应性而使受痛苦。而且，在刚刚给药一个剂量后的时间和给药另一个剂量前的时间，基因产物的水平可显著地改变。该水平的变化性对具有差的药代动力学(例如，半衰期短)或低疗效指数的治疗剂而言特别是问题。

基因治疗可用于将基因，而不是基因产物递送至显示出最适度以下的那些基因的细胞。除了在补充表达不足的或有缺陷的内源基因，基因治疗也可以递送其它的基因，所述其它的基因可能当其在靶细胞中表达时可具有有益效果的，例如细胞因子、激素、抗体或遗传修饰的蛋白质。在本文中，通过基因治疗递送的基因是指转基因。当转基因在靶细胞内稳定表达时，基因治疗具有不定期递送稳定水平的基因产物的潜能。与重复递送基因产物自身相比，基因治疗仅需要实施一次，或者至少很少发生。作为递送治疗蛋白质至脑部的方法，基因治疗是特别优选的，因为由于血脑屏障，系统给药蛋白质将不可能进入脑部，且直接立体定位注射进入脑部对于重复给药是不切实际的。

腺相关病毒介导的基因治疗

已经研究将病毒载体用于协助有效率的递送转基因至靶细胞，在本文中该方法称为转导。一种已被用于基因递送的病毒系统为腺相关病毒(AAV)。AAV为属于依赖病毒属的细小病毒。AAV具有某些在其它病毒中未发现的有吸引力的特征。首先，AAV可以感染大量的宿主细胞，包括非分裂细胞。感染非分裂细胞的能力使AAV成用于转导CNS组织例如大脑的特别好的选择。第二，AAV可以感染来自不同种类的细胞。第三，AAV与任何人类或动物疾病都无关，且似乎不会改变在整合中的宿主细胞的生物学特性。甚至，有人据计80-85％的人类人群已经暴露于该病毒。最后，AAV在大量物理和化学条件下是稳定的，其便于生成、储存和运输。

AAV基因组为线性的单链DNA分子，长度为约4681个核苷酸(nt)。AAV基因组通常包括通过在每个末端的反向重复(ITRs)连接的内部非重复基因组。ITRs为约145nt长。ITRs起DNA复制源和用于病毒基因组的包装信号的作用。

对于AAV的复制(rep)和壳体(cap)基因而言，基因组的内部非重复部分包括两个主要的可读框。rep和cap基因编码那些使病毒复制和将病毒基因组包装成病毒体的蛋白质。特别地，来自AAV rep区域的至少四个病毒蛋白质家族被表达：Rep78、Rep 68、Rep 52和Rep 40，根据它们的表观分子量命名。AAV cap区域编码至少三个蛋白质：VP1、VP2和VP3。

AAV为辅助依赖性病毒(helper dependent virus)，即，为了形成AAV病毒体，它通常需要与辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)同时感染。在不存在与辅助病毒同时感染的情况下，AAV形成了潜伏状态，其中病毒基因组持续作为附加体或者插入宿主细胞染色体，但是不会生成感染性的病毒体。随后的辅助病毒的感染“救济”整合的基因组，使其复制基因组并包装成感染性的AAV病毒体。尽管AAV可感染来自不同种类的细胞时，辅助病毒必须具有相同的种类，如宿主细胞。因此，例如，人类AAV将在用犬科腺病毒同时感染的犬科细胞中复制。

AAV载体经设计通过删除AAV基因组的内部非重复部分(即rep和cap)和在ITRs之间插入异源基因(″转基因)来递送感兴趣的基因。转基因可能与异源启动子有关。也可以包括终止信号，例如多腺苷酸化位点。