[发明专利]二酰甘油酰基转移酶测定法

说明书

发明领域

一般而言，本发明提供了测量二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的生物活性的方法。具体地，本发明提供了一种方法，用于对能够调节DGAT的生物活性的化合物进行快速、大量的筛选。更具体地，本发明提供了测量DGAT活性的测定系统，该系统使用FlashPlate^TM技术，基于特定胶束的使用。

发明背景

甘油三酯代表在真核生物中贮存的能量的主要形式。甘油三酯代谢中的失调或者不平衡与肥胖症、胰岛素抗性综合征和II型糖尿病、非酒精脂肪肝病和冠心病的病理和增加的风险有关(见，Lewis，等人，Endocrine Reviews(2002)23：201和Malloy和Kane，Adv Intern Med(2001)47：111)。此外，高甘油三酯血症通常是癌症治疗的不良后果(见Bast，等人Cancer Medicine，5th Ed.，(2000)B.C.Decker，Hamilton，Ontario，CA)。

甘油三酯合成中的一种关键酶是酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶，或者DGAT。DGAT是在哺乳动物组织中广泛表达的微粒体(microsomal)酶，其催化内质网中1，2-二酰甘油(DAG)和脂肪酰基辅酶A结合形成甘油三酯(TG)(Chen和Farese，Trends CardiovascMed(2000)10：188和Farese，等人，Curr Opin Lipidol(2000)1 1：229中综述)。最初认为DGAT在用于甘油三酯合成的两个主要途径——磷酸甘油和单酰甘油途径中唯一地控制二酰甘油向甘油三酯的酰化的最后步骤的催化。因为人们认为甘油三酯对于生存是必需的，并且认为它们的合成通过单一机制发生，所以还没有很好地研究通过抑制DGAT的活性对甘油三酯合成的抑制。

现在已经克隆和分析了编码小鼠DGAT1和相关的人类同源物ARGP1和ARGP2的基因(Cases，等人，Proc Natl Acad Sci(1998)95：13018；Oelkers，等人，J.Biol Chem(1998)273：26765)。小鼠DGAT1基因已经用于产生DGAT敲除小鼠以更好地阐明DGAT基因的功能。

出人意料地，不能表达功能DGAT酶的小鼠(Dgat-/-小鼠)可以存活并且仍然能够合成甘油三酯，表明多种催化机制促成甘油三酯合成(Smith，等人，Nature Genetics(2000)25：87)。也已经鉴定了催化甘油三酯合成的其它酶，例如，DGAT2和二酰甘油转酰酶(Buhman，J.BiolChem，上文和Cases，等人，J.Biol Chem(2001)276：38870)。小鼠中的基因敲除研究已经揭示：DGAT2在哺乳动物甘油三酯合成中起基础作用并且是存活所需的。DGAT2缺陷小鼠是脂肪减少型的，并且出生后很快死亡，这明显由于用于能量代谢的底物的极大减少和皮肤中透性屏障功能的受损(Farese等人JBC(2004)279：11767)。

显而易见地，Dgat-/-小鼠对食物诱导的肥胖症有抗性，其保持消瘦。甚至当喂饲高脂肪食物(21％脂肪)时，Dgat-/-小鼠仍然保持与喂饲常规食物(4％脂肪)的小鼠相当的体重，并且具有较低的全身甘油三酯水平。Dgat-/-小鼠中肥胖抗性不是由于降低的热量摄入导致的，这其实是增加的能量消耗以及对胰岛素和瘦素的耐受性减弱的结果(Smith，等人，Nature Genetics，上文；Chen和Farese，TrendsCardiovasc Med.上文；和Chen，等人，J Clin Invest(2002)109：1049)。此外，Dgat-/-小鼠的甘油三酯吸收率降低(Buhman，等人，J.Biol Chem(2002)277：25474)。除了提高的甘油三酯代谢之外，与野生型小鼠相比，Dgat-/-小鼠还具有提高的葡萄糖代谢，在葡萄糖负荷后，具有较低的葡萄糖和胰岛素水平(Chen和Farese，Trends Cardiovasc Med.上文)。

多种酶贡献于催化从二酰甘油合成甘油三酯的过程这一发现是重要的，因为它给予了调节该生物化学反应的一种催化机制以便以最小的不利副作用获得个体中的治疗结果的机会。例如，通过特异抑制DGAT1的人类同源物的活性来抑制二酰甘油向甘油三酯的转化的化合物将可以用于降低甘油三酯的肉体浓度和吸收，以治疗性地抵消肥胖症、胰岛素抗性综合征和明显II型糖尿病、充血性心力衰竭和动脉粥样硬化中和作为癌症治疗结果的甘油三酯的异常代谢引起的病理作用。