[发明专利]免疫球蛋白的纯化

说明书

技术领域

本发明涉及抗体制备领域，尤其是涉及对抗体进行离析和/或分离 的分离基质。本发明还包括含有本发明的分离基质的色谱柱、采用所 述分离基质分离抗体的方法、以及从原料中进行大规模纯化抗体的多 步骤工艺。

背景

免疫系统由很多相互依赖的细胞类型组成，所述细胞共同保护机体 免受细菌、寄生虫、真菌、病毒的感染，以及防止肿瘤细胞的生长。 免疫系统的卫士为在宿主的血液中不断漫游的巨噬细胞。当受到感染 或免疫激活时，巨噬系统通过吞噬标记有被称为抗原的外来分子的入 侵者而产生响应。由T辅助细胞介导的该现象引发一连串复杂的应答， 其导致B细胞的激活。而这些B细胞又产生称为抗体的蛋白，所述蛋 白与外来入侵者结合。抗体和抗原之间的结合标志着通过吞噬作用或 补体系统的活化导致外来入侵者被破环。存在有五种不同类型的抗体 或免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们不仅生理作用不同 而且它们的结构也不同。从结构角度而言，IgG抗体为被广泛研究的一 类特殊的免疫球蛋白，其可能是由于它们在成熟免疫应答中起着显著 作用。

目前在一系列不同的人和兽医诊断、卫生保健和治疗应用中对免疫 球蛋白的生物活性进行了研究。事实上，在最近的几年中，单克隆抗 体和重组抗体结构已经成为目前临床试验中研究的最大一类蛋白，并 且FDA批准其用于治疗和诊断。作为对表达系统和生产策略的补充， 设计纯化方案以简单、低成本的方式获得高纯度的抗体。

分离免疫球蛋白的传统方法基于对包括免疫球蛋白的蛋白组分的 选择性可逆沉淀，同时将其它蛋白组分留在溶液中。典型的沉淀剂为 乙醇、聚乙二醇、易溶的即抗无序的盐，例如硫酸铵和磷酸钾、以及 辛酸。典型地，这些沉淀方法得到非常不纯的产物，同时耗时、耗力。 而且，向原材料中加入沉淀剂使得很难将上清液用于其他目的，从而 产生了处理的问题，就大规模纯化免疫球蛋白而言，该问题尤为重要。

离子交换色谱法是一种公知的蛋白分级方法，常用于分离免疫球蛋 白。然而，由于带电的离子交换配体会与所有带有相反电荷的化合物 反应，因此，离子交换色谱的选择性可能会低于其它的色谱分离。

疏水作用色谱法(HIC)是另一种用于分离免疫球蛋白的方法。但 是，疏水基质要求向原材料中加入易溶盐，从而有效结合免疫球蛋白。 以连续或逐步的梯度降低易溶盐的浓度，所结合的抗体从基质上释 放。如果要求高纯度的产品，推荐采用该疏水作用色谱法并结合进一 步的步骤。由此，该方法的一个缺点是需要向原材料中加入易溶盐， 由此向大规模用户提出了一个问题而且增加了成本。对于除了细胞培 养上清液之外的原材料，例如乳清、血浆和蛋黄，向原材料中加入易 溶盐在很多情况下在大规模应用中是不允许的，其原因是，所述盐可 能阻止了不含免疫球蛋白的原材料的任意经济上可行的应用。大规模 应用的一个额外问题是几千升废物的处理。

嗜硫吸附色谱法是由J.Porath在1985年(J.Porath等；FEBS Letters，第185卷，第306页，1985)引入的一种新的用于分离免疫 球蛋白的色谱吸附法。在该篇论文中，描述了在0.5M硫酸钾即易溶盐 的存在下二乙烯砜活化的琼脂糖如何显示与免疫球蛋白的特异性结 合，所述琼脂糖偶联有包括游离巯基的不同配体。尽管所描述的用于 嗜硫吸附色谱法的基质通常显示了良好的性能，但是由于向原材料中 加入易溶盐以确保免疫球蛋白的有效结合，会产生上文所述的缺点。

亲和色谱法在分离技术中具有独特、有效的作用，因为这是唯一一 种能够基于生物功能或各自的化学结构从而对生物分子进行纯化的技 术。高选择性和高效能使得该技术理想地适合于将特定物质从复杂的 生物混合物中分离出来。在亲和色谱法中，待纯化的分子被共价连接 至不溶支持物上的配体特异性地、可逆地结合，所述配体包括互补结 合物质。在有利于其与所述固定配体特异性结合的条件下加入样品。 未结合的物质被洗掉，通过将试验条件改变至有利于其解吸的情况 下，可以回收感兴趣的物质。亲和色谱法具有浓缩的效果，其能够对 大体积的样品进行非常便利的处理。蛋白A和蛋白G亲和色谱法是分 离和纯化免疫球蛋白的常见而广泛采用的方法，尤其是分离单克隆抗 体，其主要原因是使用方便以及获得的高纯度。