[发明专利]生产具有靶向基因组修饰的卵母细胞或卵的体外方法

权利要求书

1.生产具有靶向基因组修饰的非人脊椎动物卵母细胞或卵的体外方法，该方法包括如下步骤：

a)在卵母细胞或卵的核中表达核酸内切酶，其特征在于以外源方式引入所述核酸内切酶，其特征还在于所述卵或卵母细胞的基因组DNA具有至少一个所述核酸内切酶的识别位点，该识别位点相应于至少12个碱基对的特异序列，因此允许：

(i)该核酸内切酶特异序列固定在所述的识别位点；

(ii)在所述的识别位点或在其邻近区，优选地所述邻近区在所述

识别位点的100个碱基对以内，通过所述核酸内切酶连续诱发

该基因组DNA双链断开，然后

(iii)通过同源重组机制修复所述的双链断开；以及

b)鉴定具有所需靶向基因组修饰的卵或卵母细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在该基因组DNA中存在的所述识别位点通过转基因引入。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述核酸内切酶是大范围核酸酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于该大范围核酸酶选自I-CeuI、I-CreI、I-ChuI、I-CsmI、I-DmoI、I-PanI、I-SceI、I-ScEII、1-SceIII、1-SceIV、F-SceI、F-SceII、PI-AaeI、PI-ApeI、PI-CeuI、Pl-CirI、PI-CtrI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MflI、PI-MgoI、PI-MjaI、PI-MkaI、PI-MleI、PI-MtuI、PI-MtuHI、PI-PabIII、PI-PfuI、PI-PhoI、PI-PkoI、PI-PSpI、PI-RmaI、PI-SceI、PI-SspI、PI-TfuI、PI-TliI、PI-TliII、PI-tspI、PI-TspII、PI-BspI、PI-Mchl、PI-MfaI、PI-MgaI、PI-MgaII、PI-MinI、PI-MmaI、PI-MshI、PI-MsmII、PI-MthI、PI-TagI、PI-ThyII、I-NcrI、I-NcrII、I-PanII、I-TevI、I-PopI、I-DirI、I-HmuI、I-HmuII、I-TevII、I-TevIII、F-SceI、F-SceII(HO)、F-SuvI、F-TevI和F-TevII或由它们衍生的大范围核酸酶。

5.根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的方法，其特征在于每个卵或卵母细胞以外源方式并以蛋白形式引入的所述核酸内切酶的浓度是每微升0.1-5单位，优选地每微升0.5-2.5单位。

6.根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于在断开位点的靶向基因组修饰相应于缺失或插入。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于该方法还包括在卵母细胞或卵中引入外源核酸序列的步骤，该外源核酸序列与位于该基因组DNA中核酸内切酶识别位点上下游的核酸序列具有同源性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于该引入的外源核酸序列没有任何所述核酸内切酶的识别位点。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于给予每个卵或卵母细胞的核酸序列的浓度是1-50ng/μl，优选地5-40ng/μl。

10.根据权利要求7-9中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述外源核酸序列包括被两个不同的核酸序列围绕的感兴趣的序列，这些不同的序列与分别位于该基因组DNA中核酸内切酶的识别位点上游和下游的核酸序列具有同源性。

11.根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于非人脊椎动物卵或卵母细胞是哺乳动物、爬行动物、两栖动物、禽类、昆虫或鱼类的卵或卵母细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于非人脊椎动物的卵或卵母细胞是选自鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、庸鲽、鲶鱼、斑马鱼、青鳉鱼、鲤鱼、刺鱼、astyanax、罗非鱼、金鱼、狼鲈、鲟鱼和鳕鱼的卵或卵母细胞。

13.根据上述权利要求中任一项权利要求所述的方法，其特征在于该方法还包括在适合于能使非人脊椎动物发育的条件下培养具有靶向基因组修饰的预先受精的卵母细胞或卵的步骤。