[发明专利]生产具有靶向基因组修饰的卵母细胞或卵的体外方法

说明书

本发明涉及在卵母细胞或卵中引入靶向基因组修饰(modificationgénomique ciblée)的体外方法以及在宿主细胞基因组中进行随机插入的方法。

转基因是一种分子遗传学技术，采用这种技术将外源DNA引入到多细胞生物的基因组中，并传递给其后代。这种传递给后代使所述DNA稳定整合在该胚胎的基因组中，并且在发育早熟期(stade précoce)也如此。

目前，采用最多的其中一种转基因技术是在哺乳动物卵中微量注射裸DNA的技术，该技术在许多情况下导致一部分微量注射的DNA分子整合在该卵基因组中。一些其它技术可用于转基因，特别是在活细胞中引入外源DNA的技术，这些技术是本领域技术人员熟知的，具体地是电穿孔，借助磷酸钙沉淀、脂质体或修饰脂质例如(INVITROGEN)的转染。

在外源DNA靶向整合在基因组中的情况中，需要利用同源重组机制。在这种情况下，外源DNA应该具有与在该基因组中靶向整合位点存在的核酸序列同源的核酸序列。因此这些同源重组机制在大多数生物体内是在极低的频率下进行的。最近，使用在″内含子归巢″机制中酵母内所涉及的核酸内切酶(它们属于″大范围核酸酶(méganucléase)″家族)允许在细胞培养中，尤其在哺乳动物胚胎干细胞中大大提高这些同源重组的频率(COHEN-TANNOUDJI等人，Mol.Cell.Biol.，vol.18(3)，第1444-1448页，1998)。在这些细胞中，诱导外源大范围核酸酶的表达引起在大尺寸特异核酸序列(大范围核酸酶I-SceI的18个碱基对)处基因组DNA双链断开，接着在外源DNA分子序列与围绕这个断开位点的同源序列之间发生同源重组。因此，这些大范围核酸酶能够使该基因组DNA中的感兴趣的序列置换或缺失，或把外源序列引入到该基因组DNA中，并且以″靶向(ciblée)″方式引入。

令人惊奇地，本发明人已证明，在卵中引入外源核酸序列和大范围核酸酶I-SceI时，应在其基因组中有一个被与外源核酸序列同源的序列围绕的I-SceI位点，以得到具有靶向基因组修饰的卵，这种修饰相应于在基因组I-SceI位点通过同源重组插入外源核酸序列。

本发明人的发现能够证明，如果在体内可以实施用大范围核酸酶的同源重组机制，所述机制也可以足够的效率直接在卵母细胞或卵中进行，不影响所述生物体发育的程序进行时也如此。因此，本发明的方法能够得到具有靶向基因组修饰的卵或卵母细胞，并且可能直接得到遗传修饰的成熟生物，它具有一个这样的靶向基因组修饰，并且其全部细胞都如此。所述靶向基因组修饰这时可能相应于缺失或插入，特别地插入与野生序列相比突变的序列。

卵或卵母细胞的细胞与正常细胞相比含有大量的细胞质，这样使得难以进入含有遗传物质的核中。另外，特别是用于保护卵的卵周围的膜(卵黄膜)和绒毛膜的存在制约进入该细胞。这些障碍物一般需要采用特别的技术，如直接注射细胞。可采用技术的复杂性制约了可能通过实验在几百个卵中进行处理的卵数量。

在卵或卵母细胞中靶向基因组修饰方法的可行性因此需要诱导靶向基因组修饰进行的频率足以使本领域技术人员能够在实施这样一种方法时有获得成功的合理期望。

显然，这样一种合理的成功期望在采用本发明的方法之前是不存在的。事实上，没有大范围核酸酶时，同源重组机制在卵中是一种非常稀少的遗传过程。这样一种同源重组频率很可能低于或等于在胚胎干细胞中观察的同源重组频率，即每百万细胞约一次事件。使用提高同源重组频率的大范围核酸酶，特别是在胚胎干细胞中(ES；COHEN-TANNOUDJI等人，1998，同前)，不再能使本领域技术人员实现合理的成功期望。事实上，即使在这种情况下提高同源重组频率，该频率至多达到频率6×10^-6，这非常明显地使所述技术不可用于卵。