[发明专利]改性的藻酸盐及其制备方法和应用

说明书

发明领域

本发明涉及通过本文所述的藻酸盐聚合物的化学酶改性方法制备的改性的藻酸盐，及其制备方法和应用。

发明背景

本申请要求2004年11月12日提交的美国临时申请第60/627057号，2004年11月12日提交的美国临时申请第60/627247号和2004年11月24日提交的美国临时申请第60/630867的优先权，这三份申请通过引用包括在此。

从化学意义上讲，藻酸盐是沿着分子链以嵌段形式排列的1→4连接的β-D-甘露糖醛酸(M)和α-1-古洛糖醛酸(G)的线性共聚物，M(M-嵌段)和G(G-嵌段)残基的均聚区域中散布有交替结构(MG-嵌段)的区域。从性质上讲，藻酸盐首先以均聚的聚甘露糖醛酸的形式制备，通过聚合后的差向异构化反应转化为包含M和G单体的杂聚物，所述聚合后的差向异构化反应涉及聚甘露糖醛酸M残基上的C-5转化。该反应由聚甘露糖醛酸C-5差向异构化酶催化。

近来，发现产生藻酸盐的细菌棕色固氮菌的基因组编码七种不同的聚甘露糖醛酸C-5-差向异构化酶基因。这些基因在大肠杆菌中排序、克隆和表达；由此产生的酶被称为AlgE1-AlgE7。由于所有天然藻酸盐都是通过M到G的相同基本C-5转化从均聚的聚甘露糖醛酸形成的，所以多糖中发现的组成和序列的显著差异仅仅是因为不同差向异构化酶的不同催化性质造成的。例如，AlgE4主要形成MG-嵌段的藻酸盐，AlgE6则将长G-嵌段引入聚合物。这些藻酸盐改性酶的可获得性及其应用使得能够制备具有定制的结构和物理性质的藻酸盐。

藻酸盐在二价阳离子的存在下形成交联凝胶，聚合物的G单体亚单元与离子键交联。藻酸盐在毫摩尔浓度钙的存在下快速形成凝胶取决于G残基的含量以及G和M残基的序列模式。

过去十年，人们越来越有兴趣将藻酸盐应用于越来越高要求的最终使用，例如生物技术、生物医学和药物应用。使用藻酸盐作为细胞和生物催化剂的固定化材料是这种趋势的一个例子。这些体系在工业、医学和农业中的可能应用非常广泛，从由酵母制备乙醇和由杂交瘤制备单克隆抗体，到通过俘获植物胚芽来大规模生产人工种子。

藻酸盐凝胶也可用作固定细胞、移植和组织工程的细胞外基质材料(ECM)。然而，虽然藻酸钙水凝胶具有令人感兴趣的物理和传质性质；但是因为生物学惰性(例如，细胞粘附和信号传导)使其应用受到限制。虽然藻酸盐俘获是固定活细胞的非常温和的技术，但是许多细胞需要与基质发生特异的相互作用以实现其增殖和发育。这种依赖固定的行为在大多数哺乳动物细胞中是常见的；然而藻酸盐网络本身不存在相互作用。

由于已知藻酸盐是非生物粘附性材料，所以引入细胞特异性配基或细胞外信号传导分子如肽或低聚糖是必要的，从而直接参与细胞-细胞和细胞-ECM的识别过程。这样，报道了基于这种改性的藻酸盐的第三代生物材料，能够显著提高与细胞的相互作用，揭示了聚合物工程和组织再生领域的新机会和未来发展。然而，除了基本的生物学性质，充分模拟ECM的平台设计还依赖于物理性质，例如凝胶形成、机械强度和稳定性。

藻酸盐的离子转移胶凝化性质使其成为生物技术和医学应用中吸引人的候选对象，尤其是在细胞和组织包封领域。例如，含朗格罕氏胰岛的藻酸盐-聚-L-赖氨酸胶囊(capsule)显示在大型动物中可逆转糖尿病，其中，胶囊所表现出的稳定和选择性可渗透的屏障保护移植细胞免于接触宿主的免疫系统。

已将各种配基偶联于藻酸盐聚合物以改善细胞/基质相互作用，如Mooney等于2003年11月4日公布的US 6,642,362。对藻酸盐进行化学改性的主要问题在于，这种改性常常不是化学选择性的。就是说，改性可发生在构成藻酸盐的两种糖单体(古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M))上。还已知凝胶形成(尤其是凝胶强度)是与未改性的G的数量有关的性质。现有技术中所述的藻酸盐的化学改性描述了不仅限于M残基(M单元)而且在G-嵌段的G残基(G单元)中发生的取代，从而降低可得G残基的量，因而削弱二价阳离子的协同结合并降低凝胶形成速率，凝胶形成速率降低导致盐水中凝胶形成较差和溶胀不受控制。如本文所述，“残基”指单个M或G单元，“嵌段”指多个M、G或MG单元。