[发明专利]减少含有目的维生素K依赖性蛋白质的组合物中的蛋白质污染物的含量

说明书

发明领域

本发明涉及具有非常低的，或者可以忽略的蛋白质污染物含量的维生素K依赖性蛋白质组合物。本发明还涉及可应用于制备这样的维生素K依赖性蛋白质组合物的方法。这样的方法可以单独或相继组合使用，以减少蛋白质污染物的相对含量。本发明特别涉及凝血因子的组合物的制备，所述凝血因子选自凝血因子X多肽(FX/FXa)、凝血因子IX多肽(FIX/FIXa)、凝血因子VII多肽(FVII/FVIIa)和抗凝蛋白C，特别是凝血因子VII多肽。 

发明背景 

在从微生物或细胞系的培养来生产重组蛋白的过程中，最后的生产步骤是回收和任选地浓缩目的产物。其中已经生长了细胞并且含有分泌的蛋白质和特别是细胞溶解产物(包含细胞内的目的蛋白)的培养基，除了其他污染物(例如培养基成分、核酸等)以外，或多或少还含有由细胞产生的其他蛋白质。为了获得纯化的蛋白质产物，因而需要将目的蛋白与含有该目的蛋白的粗制材料中的其他蛋白质和多肽以及其他杂质分离开。 

除去包含具有与目的多肽相同的性质的结构域的蛋白质污染物通常是困难的。 

维生素K依赖性蛋白质通过在它们的分子氨基末端部分中所共有的共同结构特征而与其他蛋白质相区别。这些蛋白质的N-末端，也称为Gla-结构域，富含稀有氨基酸γ-羧基谷氨酸，该氨基酸在由γ-谷氨 酰羧化酶催化的维生素K依赖性反应中从谷氨酸合成。由于存在大约2-12个Gla残基，Gla-结构域的特征是能够结合二价阳离子例如Ca²⁺。一旦结合金属离子，这些蛋白质发生能够通过多种技术(例如圆二色性和荧光发射)测量的构象变化。 

含Gla的蛋白质的金属诱导的构象变化的发现(Nelsestuen等人，J.Biol.Chem.1976；251，6886-6893)以及构象特异性多克隆抗体的鉴定(Furie等人，J.Biol.Chem.1978；253，8980-8987)为引入构象特异性免疫亲和层析打开了通道。这些抗体在Ca²⁺离子存在的情况下能够识别并结合Gla-结构域，但是一旦用Ca²⁺螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)除去Ca²⁺离子后就会释放出该蛋白质。 

在20世纪80年代，利用含Gla的蛋白质发生金属诱导的构象变化的独特性质而开发了构象特异性拟亲和层析(pseudoaffinitychromatography)。拟亲和层析由于没有固定化的亲和配体参与而不同于常规的亲和层析，而且它在常规的层析基质上进行(Yan S.B.，J.Mol.Recog.1996；9，211-218)。通过除去二价金属离子能够将Gla蛋白质吸附至阴离子交换材料上。随后，通过加入Ca²⁺至洗脱缓冲液中来进行洗脱。 

在1986年， 和Thim报导了利用凝血因子VII的Gla-结构域的Ca²⁺结合特性在阴离子交换材料上对重组凝血因子VII进行纯化( S.和Thim L.，Research Dislosure，1986，26960-26962.)。吸附在没有Ca²⁺的缓冲液中进行，并且用低离子强度的含Ca²⁺缓冲液和在温和条件下可以洗脱出凝血因子VII。 

Yan等人已经用相同原理纯化了重组人蛋白C(Yan S.B.等人，Bio/technology.1990；8，655-661)。 

虽然Gla-结构域的存在为分离含Gla的蛋白质与其他蛋白质提供了有利条件，但是本发明的发明人观察到，含Gla的蛋白质的类似特性和行为使得难以将它们彼此分离。针对一种Gla蛋白质的几种构象特异性抗体显示出与其他Gla蛋白质的交叉反应性(Furie B.和FurieB.，J.Biol.Chem.1979；254，9766-9771；Church等人，J.Biol. Chem.1988；263，6259-6267)。 

Brown等人(Brown等人，J.Biol.Chem.2000；275，19795-19802)已经报导了对于Gla残基特异的单克隆抗体。这些抗体可以识别所有经测试的Gla蛋白质：凝血因子VII、凝血因子IX、凝血因子II、蛋白C、蛋白S、GAS-6、骨基质Gla蛋白质、芋螺抑制肽G。