[发明专利]高质量核酸的无细胞生物合成及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产高品质核酸的方法及其用途。

背景技术

在基因转移、基因治疗和DNA疫苗中，基于DNA的治疗方法的出现加大了对在纯度、效能、功效和安全性方面满足严格的质量标准的DNA的大量需求。因为在靶组织中，基因表达的功效相对较低且持续时间相对较短，就这类应用而言，通常需要大量的DNA。

本领域的现状是依赖细菌培养物中质粒的生长以及依赖昂贵的纯化技术制造治疗品质的核酸。典型的从细菌和其他细胞源中纯化质粒的方法包括使用有机的、致突变的和有毒的化合物，包括酚、溴化乙锭、和氯化铯，以及酶，如溶菌酶、蛋白酶K和核糖核酸酶A。如果在基于DNA的治疗中，上述物质作为污染物而被注射，则构成了潜在的健康危害。这样的方法也存在一个潜在的风险，即：把不想要的污染转座子和其他的异源游离基因的DNA掺入至质粒中(Haapa，S.，Nuc.Ac.Res.，27(13)：2777-84，1999)。残余的寄主细胞核酸、其他的细胞蛋白和内毒素，也有形成污染的可能。这些混杂物不但将DNA吸收的效率降至最小，而且导致了剂量有关的毒性。为了消除这些混杂物，可接受的纯化方法经常使用多种层析措施，如阴离子交换、亲和性以及尺寸排阻。这些纯化方法非常昂贵。

美国专利号5,561,064(‘064)公开了与从细菌培养物中获得药物级别的质粒DAN有关的成就。该专利描述了用聚乙二醇溶解细菌细胞，随后在不使用额外的有毒化学药品的情况下进行一系列的层析分离以产生比较清洁的可用于基因治疗的DNA的方法。这个方法仍然依赖于在有可能有毒的细胞环境中产生质粒，尽管在纯化过程中没有加入其他的组分。

相反，由于改进的生产过程和简化的纯化方法，无细胞核酸扩增能显著节省费用，同时还排除了通常和细菌产生的质粒相伴的混杂物。体外扩增，如聚合酶链式反应(PCR)，自20世纪80年代中期以来，已经成功地用于实验室。PCR快速又经济。然而，PCR依赖于快速的热循环，这对大量的应用来说，是不切实际的。

体外等温扩增技术是公知的，但主要是用于研究核酸的复制机制。1984年，Blanco和Salas分离了噬菌体Phi29 DNA聚合酶，其是高进行性的(highly processive)链置换聚合酶。Phi29 DNA聚合酶能可靠地复制大于70,000个碱基(Phi29基因组的全长)的DNA链(Blanco，L.and Salas，M.，PNAS 81(17)：5325-5329，1984)。Phi29聚合酶用于DNA的体外高效等温扩增时需要一末端蛋白、一双链DNA结合蛋白以及一单链DNA结合蛋白(SSB)(Blanco，L.et al.，PNAS 91：12198-202，1994)。

美国专利号5,001,050(‘050)要求Phi29 DNA聚合酶在DNA测序、DNA扩增以及合成大于10,000个碱基的DNA中的用途的权利。与此有关联的美国专利，如专利号为5,198,543(‘543)和5,576,204(‘204)的专利要求修饰的Phi29 DNA聚合酶的权利，包括用于改进型测序反应中的Phi29聚合酶的核酸外切酶缺陷型。然而，这些修饰的聚合酶具有较低的保真度，且仅用在测序反应中。

实际上，环状DNA分子的复制，包括质粒和一些病毒DNA，经常通过滚环扩增(RCA)的方式发生，环状DNA模板被复制成一长串联重复多联体(concatamer)，随后该多联体被切断并包装入一蛋白外膜内(Dean，F.B.etal.，Genome Res.11：1095-99，2001)。几个试验室已经利用RCA开发了用于各种目的扩增DNA的方法，这些目的包括DNA测序、克隆、文库构建和筛选(Inoue-Nagata，et al.，J.Virological Methods 116：209-211，2003)。

美国专利号5,654,033、6,210,884、6,316,229、6,344,329以及6,797,474(分别为‘033，‘884，‘229，‘329和‘474)和RCA的技术有关，但仅用于研究性应用，如在给定的样品中测定靶信息的拷贝数目。这个方法第一次把DNA样品转变为环状模板，接着用可控制的循环扩增测定新的信息对于原信息的相对量。另一个申请将这类定量扩增和检测靶基因的突变体等位基因的能力结合起来。

美国专利号6,280,949和6,124,120公开了RCA在使用随机引物扩增全基因组中的应用。一些实施例把随机引物和特异引物结合起来扩增基因组的特定区域。